Monday, April 13, 2020

PCR Udang Vaname Terinfeksi WSSV



Udang  yang hidup ditambak air payau ada beberapa jenis, yaitu udang windu (Penaeus monodon), udang vaname (Litopenaeus vannamei), udang putih (Penaeus merguiensis) dan lain-lain. Secara alami, benih udang masuk ke dalam tambak bersama air pasang dari laut sehingga biasa disebut udang laut. Udang (golongan crustacea) yang datang ke laut banyak yang berasal dari keluarga panaeidae (Suyanto dan Takarina, 2009).

Udang vaname (Litopenaeus vannamei) saat ini telah banyak dibudidayakan di Indonesia. Para pembudidaya sudah banyak beralih ke udang vaname karena merupakan komoditas ekspor serta memiliki permintaan pasar yang cukup tinggi. Produksi udang vaname juga menunjukkan peningkatan. Pada periode tahun 2009 – 2013, menurut Direktorat Jenderal Perikanan Tangkap (2013) produksi udang vaname mengalami peningkatan yang cukup signifikan. Pada tahun 2009, jumlah produksi mencapai 170.969 ton. Pada tahun 2010, mengalami peningkatan menjadi sebesar 205.578 ton. Pada tahun 2011 dan 2012 masing-masing mengalami peningkatan menjadi sebesar 246.420 dan 251.763 ton. Pada tahun 2013 mengalami peningkatan produksi yang cukup besar yakni menjadi sebesar 386.314 ton.

Udang vaname (L. vannamei) adalah salah satu spesies udang yang bernilai ekonomis dan merupakan salah satu komoditas unggulan nasional. Udang vaname memiliki beberapa keunggulan jika dibandingkan dengan udang windu, yaitu dapat dipelihara dengan kisaran salinitas yang lebar (0,5-45 0⁄00 ), dapat ditebar dengan kepadatan yang tinggi hingga lebih dari 150 ekor/m2, lebih resisten terhadap kualitas lingkungan yang rendah karena udang memiliki sifat euryhaline yang artinya udang dapat hidup pada kisaran salinitas lebar. Hal ini sesuai pendapat Bray, et al. (1994) bahwa salah satu kelebihan udang vaname yaitu bersifat eurihalin, udang ini mampu hidup pada perairan dengan salinitas sekitar 0,5-45 0⁄00 , dan waktu pemeliharaan lebih pendek yakni sekitar 90-100 hari per siklus (Hudi dan Shahab 2005). Udang vaname juga memiliki nafsu makan yang tinggi dan dapat memanfaatkan kadar protein rendah, udang putih membutuhkan pakan dengan kadar protein 20%-35% (Briggs et al., 2004), sehingga pada sistem budidaya dengan pola semi intensif biaya pakan dapat diminimalisir (Burhanuddin, 2009). Karena keunggulan-keunggulannya tersebut, udang vaname ini memiliki prospek yang baik untuk dibudidayakan.

Namun, udang vaname juga memiliki kelemahan, salah satunya juga sering terserang berbagai penyakit. Menurut Arafani, et al. (2016), pada budidaya udang vaname kemunculan penyakit merupakan kerugian besar, berbagai penyakit akibat infeksi bakteri dan virus menyebabkan budidaya terganggu. Virus bercak putih atau white spot syndrome virus (WSSV) merupakan salah satu penyakit yang paling mengancam industri tambak udang dan krustasea lainnya di seluruh dunia. Penyakit WSSV pada udang menyebabkan gagal panen, menurunkan minat petambak untuk melakukan budidaya udang, serta mematikan tambak-tambak produktif. Virus ini termasuk genus Whispovirus dari famili Nimaviridae dengan amplop triminar. WSSV merupakan virus jenis double-standed DNA (dsDNA) yang memiliki virion yang besar (80 – 120 x 250 – 380 nm) dan berbentuk batang/elips. Vektor WSSV yaitu rotifer, moluska, cacing polychaeta, crustacean termasuk Artemia salina, copepoda, isopoda dan larva Euphydradae.

WSSV memiliki kemampuan menimbulkan penyakit (virulensi) yang sangat tinggi. Udang yang terinfeksi dapat mengalami kematian masal beberapa hari setelah terjadinya infeksi. WSSV menjadi semakin sulit diatasi karena banyaknya inang jenis krustacea yang dapat berfungsi sebagai reservoir alami (Hossain, et al., 2001), kemampuannya yang cukup lama untuk bertahan dilingkungan, serta minimnya pengetahuan tentang virus ini pada level molekuler. Penyakit bintik putih telah diketahui disebabkan oleh virus WSSV dan teknik deteksi menggunakan PCR (Polymerase Chain Reaction) telah dikembangkan untuk diagnosa cepat agar dapat mencegah masuknya virus pada sistem budidaya.

Berdasarkan hal di atas, untuk mengatasi permasalahan infeksi virus di tambak, perlu dilakukan upaya untuk mendeteksi secara cepat dan akurat serta seleksi terhadap udang yang dibudidayakan. Salah satu cara untuk mendeteksi penyakit WSSV tersebut dapat dilakukan dengan deteksi gen dari agen pembawa penyakit tersebut dengan menggunakan metode berbasis DNA seperti PCR (Polymerase Chain Reaction). PCR mempunyai beberapa keunggulan dibandingkan metode diagnosa lain, antara lain spesifik (mampu mendeteksi suatu pathogen penyebab penyakit pada tingkat DNA, sensitif (mampu mendeteksi penyakit dalam tahap subklinis atau carrier), cepat (keseluruhan proses pemeriksaan penyakit dengan metode PCR dapat diselesaikan dalam waktu 5 jam), efisien (PCR dapat melakukan pemeriksaan terhadap 48-96 sampel sekaligus) dan praktis (hanya menggunakan satu alat saja dapat memeriksa penyakit udang. Deteksi dini dengan menggunakan teknik PCR terhadap berbagai virus terutama virus WSSV menjadi kunci dalam keberhasilan budidaya udang vaname di Balai Besar Perikanan Budidaya Air Payau Jepara, Jawa Tengah. Pengujian PCR dapat juga digunakan saat menyeleksi benur siap tebar di tambak, sehingga benur berkualitas karena bersifat Specific Pathogen Free (SPF).

MAKSUD DAN TUJUAN     
Maksud dari Praktik Kerja Magang (PKM) ini adalah untuk membandingkan dan menerapkan teori yang telah diterima selama perkuliahan dengan kondisi di lapang, serta sebagai pengetahuan, pengalaman, dan keterampilan mengenai deteksi white spot syndrome virus (WSSV) pada udang vaname (L. vannamei) di Balai Besar Perikanan Budidaya Air Payau (BBPBAP) Jepara, Jawa Tengah.

Adapun tujuan dari praktik kerja magang ini, yaitu mengetahui proses deteksi dini terhadap virus WSSV pada udang vaname dengan menggunakan metode PCR (Polymerase Chain Reaction).

KEGUNAAN
Kegunaan dari Praktik Kerja Magang ini adalah untuk menambah pengetahuan, pengalaman, dan ketrampilan tentang masalah-masalah yang dihadapi dalam kegiatan magang serta sebagai sumber informasi untuk penelitian lebih lanjut bagi deteksi White spot syndrome virus (WSSV) pada udang vaname (Litopenaeus vannamei).

WAKTU DAN TEMPAT
Praktik Kerja Magang (PKM) ini dilaksanakan di Balai Besar Perikanan Budidaya Air Payau (BBPBAP) Jepara, Jawa Tengah pada tanggal 25 Juni sampai  10 Agustus 2018.

TINJAUAN PUSTAKA

KLASIFIKASI DAN MORFOLOGI UDANG VANAME (LITOPENAEUS VANNAMEI)
Klasifikasi udang vaname menurut Wyban dan Sweeney (1991) adalah sebagai berikut:
Phylum : Arthropoda
Class : Crustacea
Subclass : Malacostracea
Seri : Eumalacostraca
Superordo : Eucarida
Ordo : Decapoda
Subordo : Dendrobrachiata
Infraordo : Penacidea
Superfamily : Pecidea
Family : Penaeidae
Genus : Penaeus
Subgenus : Litopenaeus
Spesies : Litopenaeus vannamei

Menurut Manoppo (2011), tubuh udang vaname berwarna putih transparan sehingga lebih umum dikenal sebagai “White shrimp”. Tubuh sering berwarna kebiruan karena lebih dominannya kromatofor biru. Panjang tubuh dapat mencapai 23 cm. Udang vaname dapat dibedakan dengan spesies lainnya berdasarkan pada eksternal genitalnya. Panjaitan (2012) menambahkan bahwa udang vaname mempunyai tubuh beruas-ruas seperti udang penaeid lainnya, dimana pada tiap ruasnya terdapat sepasang anggota badan. Udang vaname termasuk ordo decapoda yang dicirikan memiliki sepuluh kaki terdiri dari lima kaki jalan dan lima kaki renang. Tubuh udang vaname secara morfologis dibedakan menjadi dua bagian yaitu cephalotorax atau bagian kepala dan dada serta bagian abdomen atau perut. Bagian cephalotorax terlindung oleh kulit chitin yang tebal disebut carapace. Secara anatomi cephalotorax dan abdomen terdiri dari segmen-segmen atau ruas-ruas, dimana masing-masing segmen tersebut memiliki anggota badan yang mempunyai fungsi sendiri-sendiri. Morfologi udang vaname dapat dilihat pada Gambar 1.


Gambar 1. Udang vaname (Litopenaeus vannamei) (Amri dan Kanna, 2008).

HABITAT UDANG VANAME (L. VANNAMEI)
Habitat udang vaname usia muda adalah air payau, seperti muara sungai dan pantai. Semakin dewasa udang jenis ini semakin suka hidup di laut. Ukuran udang menunjukan tingkat usai. Dalam habitatnya, udang dewasa mencapai umur 1,5 tahun. Pada waktu musim kawin tiba, udang dewasa yang sudah matang telurnya atau calon spawner berbondong-bondong ke tengah laut yang dalamnya sekitar 50 meter untuk melakukan perkawinan. Udang dewasa biasanya berkelompok dan melakukan perkawinan, setelah betina berganti cangkang (Nadhif, 2016).

Di alam udang ini menyukai dasar berlumpur pada kedalaman dari garis pantai sampai sekitar 72 m. Hewan ini juga telah ditemukan menempati daerah mangrove yang masih belum terganggu. Udang ini nampaknya dapat beradaptasi dengan perubahan temperatur dan tekanan di alam. Udang vaname dapat beradaptasi dengan baik pada level salinitas yang sangat rendah (Manoppo, 2011).

PENYAKIT YANG BIASA MENYERANG UDANG VANAME (L. VANNAMEI)
Akhir-akhir ini muncul beberapa penyakit yang menyerang udang. Telah diketahui adanya infeksi penyakit oleh virus atau virus-like pada komoditas udang di Indonesia, terutama oleh white spot baculo virus (WSBV) dan monodon baculo virus (MBV), yang saat ini sering disebut dengan penyakit bercak putih atau white spot syndrome virus (WSSV). Kematian udang pada usia satu sampai dua bulan di tambak sudah menjadi hal yang umum sebagai akibat serangan virus bercak putih, yang mengakibatkan ribuan hektar tambak tidak bisa berproduksi lagi. Hal ini berdampak terhadap kerugian negara yang diperkirakan mencapai 2,5 trilyun rupiah per-tahun. Pada tambak udang, virus ini bisa mengakibatkan total kematian 100% pada 2 sampai 10 hari penyerangan. Mekanisme penyerangan WSSV ke tubuh udang awalnya bersifat intrasitoplasmik masuk ke dalam sel inang, kemudian pada tingkat serangan yang lebih tinggi deoxyribonucleic acid (DNA) virus masuk ke dalam DNA inang dan mengambil alih proses transkripsi dan translasi sesuai proses dalam DNA virus. Pada tahap transkripsi dan translasi tersebut gen WSSV mengekspresikan suatu protein non struktural yang dinamakan protein ICP11, yang diduga sangat berperan pada infeksi WSSV (Kilawati dan Maimunah, 2015).

Model Morphogenesis white spot syndrome virus (WSSV) pada sel inang penularan virion WSSV menggunakan selubung protein dengan motif penyerangan sel. WSSV masuk kedalam sel. Selubung viron WSSV menyatu dengan endosome dan nukleokapsid telanjang yang terangkut dalam nukleus, seperti pada baculovirus, Nukleokapsid telanjang WSSV menyerang membran nukleus, dan genome WSSV dilepaskan dalam nucleus. Genome WSSV mulai mereplikasi, Dalam sitoplasma, mitokondria mulai mengalami kerusakan. Dalam nukleus stroma virus awalnya kelihatan seperti materi bebas yang berisi butir-butiran kecil. Sel kromatin terakumulasi dekat membran nukleus dan Retikulum Endoplasma Kasar (REK) yang membesar dan aktif, Dinding kromatin terjadi perubahan dalam zona cincin yang tebal. Stroma virus dengan kepadatan rendah mulai membentuk gelembung yang akan terbentuk selubung virus. Gelembung mungkin terbentuk dengan membran materi yang dibentuk dalam zona cincin, seperti pada baculovirus, Partikel WSSV yang baru terkumpul dalam nukleus yang didalamnya ada elektron dense. Selubung yang kosong akan diisi dengan nukleus akan terganggu, Virion WSSV telah kompit bentuknya dan siap untuk lepas dari sel yang terinfeksi untuk memulai siklus dalam sel lain yang dapat diinfeksi. Udang yang terinfeksi WSSV akan mengalami perubahan tingkah laku yaitu menurunnya aktivitas berenang, berenang tidak terarah, dan sering kali berenang pada salah satu sisinya saja. Selain itu udang cenderung bergerombol di tepi tambak dan berenang ke permukaan. Pada fase akut terdapat bercak-bercak putih pada karapas dengan diameter 0.5 – 3.0 mm, dan bercak putih ini pertama kali muncul pada cephalothorax, segmen ke 5 dan ke 6 dari abdominal dan terakhir menyebar keseluruh kutikula tubuhnya. Pada kasus WSSV adanya bintik atau spot putih pada bagian karapas sudah menjadi tanda umum, tetapi pada induk udang warnanya menjadi merah. Udang yang terserang penyakit ini dalam waktu singkat dapat mengalami kematian (Mahardika, et al., 2004).

WHITE SPOT SYNDROME VIRUS (WSSV)

KLASIFIKASI DAN MORFOLOGI
White spot syndrome virus atau virus penyebab bercak putih ini diberi nama system ectodermal and mesodermal baculovirus karena virus ini menyerang organ yang berasal dari jaringan ektodermal dan mesodermal, sedangkan Takasih et al, (1994) memberi nama Baciliform virus karena virus ini berbentuk batang dengan ukuran 83-275 nm (Wijayanti, 1999)

Sedangkan menurut pendeteksian virus, virus ini tergolong ke dalam klasifikasi sebagai berikut:
Famili         : Nimriviridae
Genus        : Whisporus
Spesies     : White spot syndrome virus (WSSV)

Nama Nimaviridae berasal dari bahasa latin yang berarti 1 benang atau perpanjangan pada ujung partikel virus  yang berbentuk seperti ekor. Keberadaan ekor dan adanya perulangan pada genom DNA inilah yang membuat mirip dengan kelompok baculovirus, namun secara filogenetik DNA Nimaviridae berbeda dengan DNA virus pada umumnya (Vlak et al, 2002).

PATOGENITAS
Udang yang terserang WSSV akan menunjukan gejala klinis berupa nafsu makan berkurang, lemah, anoreksia, lethargi, bagian abdomen berwarna kemerahan dan bintik putih, serta lepasnya kutikula dari tubuh (Bower, 1996).

Fase awal infeksi WSSV adalah adanya bintik putih pada kulit yang menyebar ke seluruh tubuh dan berkembang semakin banyak diikuti dengan melebarnya bintik putih menjadi bercak (Rochman, 1995) Bercak putih timbul karena adanya deposit kalsium oleh epidermis kutikula (Lighter, 1996) Menurut Techner (1995) bercak putih timbul karena adanya deposit kasium oleh epidermis kutikula (Lighter, 1996) Menurut Techner (1995) bercak putih timbul karena adanya deposite.

METODE DETEKSI PENYAKIT
Diagnosa penyakit atau deteksi virus ini bisa dilakukan dengan beberapa teknik. Metode yang sederhana dapat dilakukan menggunakan teknik histologi dengan pewarnaan H&E. Metode lain adalah dengan metode molekuler yaitu Polymerase Chain Reaction (PCR) dan Reverse Transcriptase- Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) dengan teknik yang lebih cepat dan tepat menggunakan spesifik primer. Selain itu, saat ini telah tersedia beberapa kit komersial yang memudahkan dalam proses pengerjaannya. Teknik terkini lainnya adalah Quantitative PCR (qPCR) ataupun Quantitative RT-PCR (qRT-PCR) yang dapat mendeteksi secara kuantitatif dan sangat akurat di dalam mendeteksi adanya infeksi (Koesharyani dan Gardenia, 2015).

Deteksi secara molekuler merupakan metode deteksi yang sangat sensitif dan spesifik, namun prosedur analisisnya mulai dari ektraksi DNA/RNA, amplifikasi dan elektroforesis harus dikerjakan secara aseptis di dalam laboratorium yang terkontrol dan memerlukan alat laboratorium yang khusus dan rumit. Tetapi dengan berkembangnya metode diagnosa, saat ini telah ada teknik diagnosa berbasis molekuler yang dapat dikerjakan langsung di lapangan “on the spot” menggunakan Pockit (iiPCR) metode ini adalah salah satu teknik deteksi dengan menggunakan portable-PCR (Rapid Test on the spot). Teknik ini dapat dengan mudah dikerjakan oleh petani di lapangan (tambak atau hatchery) dan dapat dikerjakan di luar laboratorium dengan proses amplifikasi yang bersifat semi-kit tanpa proses elektroforesis dan hasil akhir secara kualitatif dapat dilihat langsung pada mesin amplifikasi (Koesharyani dan Gardenia, 2015).

POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR)

DEFINISI DAN CARA KERJA
PCR (Polymerase Chain Reaction) adalah suatu teknik sintesis dan amplifikasi DNA secara in vitro. Teknik ini pertama kali dikembangkan oleh Karry Mullis pada tahun 1985. Teknik PCR dapat digunakan untuk mengamplifikasi segmen DNA dalam jumlah jutaan kali hanya dalam beberapa jam. Dengan diketemukannya teknik PCR di samping juga teknik-teknik lain seperti sekuensing DNA, telah merevolusi bidang sains dan teknologi khususnya di bidang diagnosa penyakit genetik, kedokteran forensik dan evolusi molekular (Handoyo dan Rudiretna, 2001).

PCR merupakan teknologi yang mampu melipat gandakan sedikit fragmen DNA yang terdapat dalam komplek makromolekul genom dari berbagai sumber (hewan, tumbuhan, bakteri, dan virus) menjadi 2n kali lipatnya secara enzimatis. Teknologi ini juga dikenal dengan tingkat sensitifitas yang cukup tinggi karena hanya membutuhkan secuplik sampel DNA saja untuk mendapatkan jutaan kopi DNA baru. Teknologi PCR sudah banyak digunakan pada penelitian hayati (kesehatan, lingkungan, dan pertanian) yang kemudian juga pengurutan kode genetika manusia berhasil diselesaikan, berbagai jenis obat-obatan baru ditemukan, spesies-spesies baru berhasil diidentifikasi dan penanganan penyakit-penyakit berbahaya seperti kanker dan penyakit menular bisa lebih dini dideteksi (Budiarto, 2015).

KELEBIHAN DAN KELEMAHAN PCR
Keunggulan PCR dikatakan sangat tinggi. Hal ini didasarkan atas spesifitas, efisiensi dan keakuratannya. Spesifitas PCR terletak pada kemampuannya mengamplifikasi sehingga menghasilkan produk melalui sejumlah siklus. Keakuratan yang tinggi karena DNA polymerase mampu menghindari kesalahan pada amplifikasi produk. Masalah yang berkenaan dengan PCR yaitu biaya PCR yang masih tergolong tinggi. Selain itu kelebihan lain metode PCR dapat diperoleh pelipatgandaan suatu fragmen DNA (110 bp, 5x10-9 mol) sebesar 200.00 kali setelah dilakukan 20 siklus reaksi selama 220 menit. Reaksi ini dilakukan dengan menggunakan komponen dalam jumlah sangat sedikit, DNA cetakan yang diperlukan hanya sekitar 5 µg oligonukleotida yang diperlukan hanya sekitar 1 mM dari reaksi ini biasa dilakukan dalam volume 50-100 µl. DNA cetakan yang digunakan juga tidak perlu dimurnikan terlebih dahulu sehingga metode PCR dapat digunakan untuk melipatgandakan suatu sekuen DNA dalam genom bakteri hanya dengan mencampukan kultur bakteri di dalam tabung PCR (Yusuf, 2010).

Menurut Brookes (1999), metode PCR mempunyai kelemahan yaitu hanya bisa digunakan kalau sudah diketahui informasi sekuens DNA yang hendak dikloning, sangat mudah terkontaminasi, biaya peralatan reagen yang mahal, interpretasi hasil PCR yang positif belum tervalidasi untuk semua penyakit infeksi (misalnya infeksi pasif atau laten), serta teknik prosedur yang kompleks dan bertahap membutuhkan keahlian khusus untuk melakukannya.

METODE PRAKTIK KERJA MAGANG

METODE PELAKSANAAN
Metode yang digunakan dalam Praktik Kerja Magang (PKM) ini adalah metode deskriptif. Menurut Suryabrata (1991), metode deskriptif adalah suatu metode yang menggambarkan keadaan atau kejadian-kejadian pada suatu daerah tertentu. Dalam metode ini pengambilan data dilakukan tidak hanya terbatas pada pengumpulan dan penyusunan data, tapi meliputi analisis dan pembahasan tentang data tersebut. Metode ini bertujuan untuk memberikan gambaran secara umum, sistematis, aktual dan valid mengenai fakta dan sifat-sifat populasi daerah tersebut.Informasi-informasi yang akurat dan faktual perlu dicari untuk menunjang terpenuhinya data yang dibutuhkan. Penggunaan metode deskriptif di harapkan dapat menggali data-data mengenai deteksi WSSV pada udang vaname (L. vannamei) dengan menggunakan PCR. Setelah data diperoleh, dianalisis dan dilakukan verifikasi, kemudian data disusun untuk laporan kerja magang.

TEKNIK PENGUMPULAN DATA
Pengumpulan data pada Praktik Kerja Magang (PKM) ini dilakukan dengan dua macam data, yaitu pengambilan data primer dan data sekunder. Data primer didapatkan dengan cara mencatat hasil observasi, wawancara serta partisipasi aktif, sedangkan data sekunder yaitu data atau informasi yang dikumpulkan dan dilaporkan oleh seseorang untuk suatu tujuan tertentu maupun sebagai pengetahuan ilmiah.

DATA PRIMER
Data primer merupakan data yang diperoleh langsung dari subyek penelitian, dalam hal ini data diperoleh dari informasi langsung dengan menggunakan instrumen yang telah ditetapkan. Data primer dapat berupa observasi, wawancara serta partisipasi aktif.

OBSERVASI
Menurut Purhantara (2010), observasi merupakan pengamatan peneliti pada obyek penelitiannya. Instrumen yang digunakan dapat berupa lembar pengamatan, panduan pengamatan dan alat perekam. Data yang diperoleh melalui observasi sangat rinci serta kaya dengan macam-macam informasi yang bila dilakukan secara lisan  tidak mungkin diperoleh. Metode observasi ini dibagi menjadi 2 yakni observasi langsung dimana peneliti secara langsung mengamati apa yang ingin diperoleh sebagai data dan observasi tidak langsung dimana peneliti menggunakan dokumentasi seperti: foto dan video dalam pengumpulan data. Observasi yang dilakukan dalam Praktik Kerja Magang ini antara lain, mengamati secara langsung bagaimana proses uji PCR untuk dapat mendeteksi virus yang ada pada udang vaname. Observasi berarti mengumpulkan data langsung dari lapangan. Proses observasi dimulai dengan mengidentifikasi tempat yang hendak diteliti. Data yang didapatkan dari observasi berupa gambar lokasi penelitian, gambar alat dan bahan, gambar prosedur percobaan dan gambar hasil percobaan.

WAWANCARA
Wawancara merupakan salah satu teknik pengumpulan data, dimana pelaksanaanya dapat dilakukan secara langsung pada subyek atau responden. Menurut  Purhantara (2010), wawancara adalah proses percakapan dengan maksud untuk mengontruksi mengenai orang, kejadian dan kegiatan yang dilakukan antara dua pihak, yaitu pewawancara dan responden. Wawancara dilakukan bertujuan untuk memperoleh jawaban yang bertolak pada masalah penelitian yang dilakukan. Wawancara yang dilakukan pada Praktik Kerja Magang dengan melakukan tanya jawab langsung dengan kepala laboratorium, teknisi alat, peneliti yang berada di Laboratorium Manajemen Kesehatan Hewan Akuatik (MKHA), Balai Besar Perikanan Budidaya Air Payau (BBPBAP) Jepara. Dari hasil wawancara tersebut kemudian akan didapatkan data atau informasi awal mengenai prosedur deteksi virus dengan teknik PCR, alat dan bahan yang digunakan, serta tahapan atau proses yang akan dilakukan. Metode ini kebanyakan digunakan untuk memperoleh informasi secara langsung, mendalam, tidak terstruktur, dan individual. Data yang didapatkan dari proses wawancara adalah daftar alat bahan, prosedur serta metode dan hasil dari penelitian sebelumnya jika ada.

PARTISIPASI AKTIF
Dalam memperoleh informasi tidaklah cukup dengan cara obsevasi saja, hal ini juga dapat dilakukan melalui partisipasi aktif untuk memperkuat data yang telah kita peroleh sebelumnya. Sugiyono (2009), menyatakan bahwa dalam observasi partisipasi, peneliti terlibat dengan kegiatan sehari-hari orang yang sedang diamati atau yang digunakan sebagai sumber data penelitian. Sambil melakukan pengamatan, peneliti ikut melakukan apa yang dikerjakan oleh sumber data. Dengan observasi partisipan ini, maka data yang diperoleh akan lebih lengkap, rinci dan sampai mengetahui pada tingkat makna dari setiap perilaku yang nampak. Dalam observasi partisipasi, peneliti mengikuti apa yang dikerjakan orang, mendengarkan apa yang diucapkan narasumber dan berpartisipasi dalam semua aktivitas. Kegiatan partisipasi aktif dalam praktik kerja magang ini, yaitu kegiatan yang dimaksudkan meliputi persiapan sampel, pembuatan media, deteksi WSSV menggunakan PCR.

DATA SEKUNDER
Data sekunder adalah data atau informasi yang dikumpulkan dan dilaporkan oleh seseorang sebagai pengetahuan ilmiah. Data ini biasanya diperoleh dari pustaka atau laporan peneliti terdahulu. Menurut Sugiono (2009), data sekunder adalah sumber yang tidak langsung memberikan data kepada pengumpul data bisa melalui perantara orang lain maupun melalui dokumen. Dalam Praktik Kerja Magang (PKM) ini, data sekunder diperoleh melalui melalui laporan-laporan pustaka serta data yang diperoleh dari pihak lembaga pemerintah maupun masyarakat sekitar, landasan teoritis dari buku-buku  yang berkaitan dengan pembahasan masalah atau dari informasi lain yang relevan yang terkait dengan teknik PCR (Polymerase Chain Reaction). Data sekunder tersebut meliputi sejarah berdirinya lokasi dan letak geografis serta struktur organisasi.
HASIL DAN PEMBAHASAN

KEADAAN UMUM LOKASI PRAKTIK KERJA MAGANG
Secara aspek ekonomi, persyaratan lokasi budidaya telah terpenuhi. Selain BBPBAP Jepara dekat dengan pasar, BBPBAP Jepara terletak pada 3 km dari pusat kota sehingga sarana produksi mudah diperoleh, sarana transportasi lancer, komunikasi dengan para konsumen serta para distributor juga mudah, sehingga dalam pemasaran komoditas mudah dilakukan. BBPBAP Jepara terletak di tepi pantai laut Jawa, hal ini memenuhi secara aspek teknis, karena sumber air laut terpenuhi sepanjang tahun namun bukan merupakan daerah banjir. Wilayah BBPBAP Jepara terletak jauh dari pabrik atau tempat industri lainnya, sehingga air yang digunakan juga terbebas dari sumber polutan.

Selain itu, ketersediaan air tawar untuk kebutuhan budidaya juga tercukupi dengan baik. Secara aspek sosial juga memenuhi persyaratan, yaitu terdiri dari kompleks kampus 10 ha dan areal pertambakan 54.5472 ha. Kompleks kampus terdiri dari perkantoran, perumahan, asrama unit pembenihan, laboratorium, dan lapangan olahraga. Sehingga dibutuhkan banyak tenaga kerja dari penduduk sekitar BBPBAP Jepara, meskipun mayoritas karyawan bukan berasal dari kota tersebut.

SEJARAH DAN LATAR BELAKANG BERDIRINYA BBPBAP JEPARA
Pada tahun 1971, diawali dengan berdirinya lembaga Research Center Udang (RCU) yang berada di bawah Badan Penelitian dan Perikanan, Departemen Pertaniam. Sasaran utamanya adalah meneliti siklus hidup udang windu (Penaeus monodon) dari proses kematangan telur (gonad), perkembangan larva hingga dewasa secara terkendali untuk selanjutnya dibudidayakan di tambak.

Pada tahun 1978 berdasarkan SK Menteri Pertanian RI No. 306/Kpts/Org/5/1978 tentang susunan organisasi dan tatalaksana balai, telah diatur dan ditetapkan lembaga yang semula bernama Research Center Udang menjadi Balai Budidaya Air Payau (BBAP). BBAP Jepara ini merupakan Unit Pelaksana Teknis (UPT) yang berada di bawah Direktorat Jenderal Perikanan, Departemen Pertanian. Seiring dengan perkembangan kemajuan teknologi akuakultur, dimana komoditas yang dikembangkan tidak hanya terbatas pada udang windu saja, tetapi juga komoditas ikan bersirip, Echinodermata dan Molusca air.

Pada periode ini BBAP Jepara telah berhasil menorehkan prestasi gemilang yang menjadi pendorong bagi perkembangan industri udang secara nasional. Keberhasilan yang diraih adalah dengan diterapkannya teknik pematangan gonad induk udang dengan cara ablasi mata, sehingga hal tersebut dapat mengatasi kesulitan penyediaan induk matang telur yang pada masa itu merupakan masalah yang serius. Dengan keberhasilan penemuan teknik ablasi mata tersebut telah berpengaruh positif terhadap perikanan usaha pembenihan (hatchery).

Selanjutnya selain keberhasilannya dalam hal teknik ablasi mata, pada periode 1979-1988 BBAP Jepara juga telah berhasil melakukan pengkajian teknologi pembenihan udang skala rumah tangga (backyard hatchery). Dalam waktu yang singkat usaha backyard hatchery ini telah berkembang meningkatkan pendapatan masyarakat pesisir dan nelayan sekitar Jepara. Sejak tahun 1993 usaha ini mulai berkembang ke daerah-daerah lain di Indonesia. Pada era masa kepemimpinan Presiden KH. Abdulrahman Wahid telah dibentuk Departemen Eksplorasi Laut dan Perikanan yang merupakan cikal bakal Kementerian Kelautan dan Perikanan. Hingga akhirnya berdasarkan SK Menteri Kelautan dan Perikanan No. : 26C/MEN/2001, BBAP Jepara mengalami perubahan nama dan status (eselonisasi) menjadi Balai Besar Perikanan Budidaya Air Payau (BBPBAP), peningkatan status dari eselon III menjadi eselon II. Kedudukan BBPBAP Jepara merupakan Unit Pelaksana Teknis yang secara administrative dan teknis bertanggung jawab pada DIrektorat Jenderal Perikanan Budidaya, Kementerian Kelautan dan Perikanan (BBPBAP Jepara, 2017).

LETAK GEOGRAFIS DAN KEADAAN SEKITAR
Balai Besar Perikanan Budidaya Air Payau (BBPBAP) Jepara terletak di Jalan CIk Lanang, Desa Bulu, Kecamatan Jepara, Kabupaten Jepara, Jawa Tengah. Telepon (0291) 591125 dan FAX (0291) 591724. Website bbpbapjepara.djpb.kkp.go.id dan alamat email bbpbapjpr@gmail.com Secara astronomis, BBPBAP Jepara terletak pada 1100 390 11 BT dan 60 350 10 LS. Kondisi topografinya adalah pantai dengan perairan berkarang, pasir landai, dimana pada datarannya adalah cenderung liat sehingga air laut sesuai untuk budidaya. BBPBAP Jepara terletak pada ketinggian antara 0.5 – 3 meter di atas permukaan air laut. Daerah tersebut menjadi daerah yang bebas banjir pada musim hujan. Batas-batas wilayahnya meliputi :
-        Sebelah Utara               : Pantai Utara Jawa
-        Sebelah Selatan           : Pantai Kartini
-        Sebelah Timur              : Desa Kauman
-        Sebelah Barat               : Pulau Panjang

STRUKTUR ORGANISASI
Penjelasan struktur organisasi BBPBAP Jepara dapat dilihat pada Gambar 2.



Gambar 2. Struktur Organisasi BBPBAP Jepara


Dari gambar struktur organisasi BBPBAP Jepara di atas, dapat disimpulkan struktur BBPBAP Jepara termasuk dalam bentuk organisasi fungsional dan staff. Dimana bentuk fungsional dalam pelaksanaannya kepala balai dapat memerintah langsung kepada pelaksana kelompok fungsional  dan kelompok fungsional ini juga dapat berhubungan secara langsung kepada kepala balai apabila dalam pelaksanaan mengalami hambatan maupun memberikan saran dalam pelaksanaannya. Dalam hubungannya antara kepala balai dengan kepala sub bagian tata usaha, kepala seksi pelayanan teknis dan informasi dan kepala seksi sarana teknis tergolong dalam bentuk staff, dimana dalam pelaksanaannya kepala memerintahkan kepada satuan organisasi di bawahnya dalam bidang pekerjaan tertentu, pimpinan tiap bidang kerja berhak memerintahkan kepada pelaksana sepanjang menyangkut bidang kerjanya.

Apabila dalam pelaksanaannya mengalami hambatan maupun pelaksana ingin memberikan suatu masukan sub bagian harus menyampaikan kepada kepala bagian untuk disampaikan kepada kepala balai, sub bagian tidak berwenang untuk berhubungan secara langsung kepada kepala balai. Bentuk organisasi fungsional dan staff sesuai dengan pendapat Sutarto (1991) yang menyatakan bahwa bentuk organisasi fungsional dan staff adalah suatu organisasi yang wewenang dari puncak pimpinan dilimpahkan kepada satuan-satuan organisasi di bawahnya dalam bidang pekerjaan tertentu, pimpinan tiap bidang kerja dapat memerintah semua pelaksana yang ada sepanjang menyangkut bidang kerjanya dan di bawah puncak pimpinan atau pimpinan satuan diangkat pejabat yang tidak memiliki wewenang komando tetapi hanya dapat memberikan nasehat tentang bidang keahlian tertentu.

TUGAS DAN FUNGSI BBPBAP JEPARA
Tugas pokok Laboratorium MKHA BBPBAP Jepara antara lain :
1. Melayani diagnosa penyakit (biomolekuler)
2. Merekomendasikan dan menerapkan teknik pengendalian HPI serta pengelolaan lingkungan budidaya secara sistematis, komprehensif, terintegrasi dan terkoorinasi
3. Memantau daerah sebaran dan perkembangan HPI wilayah kerjanya dan menyimpan data sebagai data standart
4. Menyediakan dan menyebarkan teknologi pengendalian HPI
5. Mengoperasionalkan laboratorium terkait dan menyediakan informasi status penyakit ikan di wilayah kerjanya
6. Menguji penggunaan bahan kimia/antibiotik/herbal therapy dan material lainnya
7. Melakukan pengambilan dan penyimpanan specimen untuk dikoleksi dan mengiriim ke laboratorium rujukan
8. Memonitor kesehatan ikan dan lingkungan dilakukan secara berkala, aktif dan proaktif terhadap kasus penyakit
9. Melaporkan hasil monitoring HPI dan lingkungan secara berkala dan insidentil

Laboratorium hama dan penyakit ikan BBPBAP Jepara juga memiliki fungsi untuk melakukan pemeriksaan dan pengujian hama dan penyakit ikan yakni dari golongan penyakit viral, bacterial, cendawan maupun parasit. Laboratorium tersebut mencakup laboratorium biologi molekuler, laboratorium parasitology dan laboratorium basah.

Metode pemeriksaan dan pengujian hama dan penyakit ikan yang dilakukan di Laboratorium Pengujian Mutu Perikanan Budidaya BBPBAP Jepara meliputi pemeriksaan gejala klinis, identifikasi, isolasi bakteri, virus maupun jamur, baik dengan uji biokimia, konvensional, histopatologi, imunologi dan biologi molekuler dengan PCR. Pengelolaan sampel di laboratorium bisa dilihat pada Lampiran 1.

LABORATORIUM MANAJEMEN KESEHATAN HEWAN AKUATIK (MKHA)
Laboratorium Biologi Molekuler merupakan laboratorium yang menjadi bagian dari Laboratorium Kesehatan Hewan Akuatik di BBPBAP Jepara. Peralatan yang terdapat pada laboratorium MKHA sebagai berikut:

ALAT DAN BAHAN

ALAT
Alat-alat yang digunakan untuk mengambil histopatologi ikan antara lain (Lampiran 6):
- Lemari Es :  untuk tempat penyimpanan sampel.
- Autoclave :  untuk sterilisasi alat dan bahan.
- Sentrifuge 10.000 rpm :  untuk memisahkan supernatan.
- Thermall Cycler :  untuk penggandaan DNA dan RNA.
- Inkubator :  untuk inkubasi sampel.
- Laminary air flow : untuk tempat melakukan kegiatan ekstraksi DNA.
- Timbangan digital :  untuk menimbang bubuk agarose.
- Oven : untuk mencairkan agarose yang memadat.
- Micropipet : untuk pemindahan larutan sampel skala microlit.
- Keranjang alat : untuk tempat blue, yellow dan white tip.
- Cetakan agar : untuk pembuatan sumur pada agarose.
- Gunting : untuk menghaluskan dan memotong sampel.
- Pinset : untuk pemindahan sampel benur udang.
- Gayung air : untuk pengambilan air.
- Pellet pastel : untuk menghaluskan sampel saat ekstraksi DNA.
- Spin down : untuk perlakuan putaran agar seluruh komponen berada di bawah tabung
- Bunsen :  untuk tempat spiritus.
- Blue Tip : untuk dipasangkan dengan mikropipet kapasitas volume maksimal 1.000 µl dengan ketelitian 1µl.
- Tangki elektroforesis : untuk menghantarkan arus listrik dan terjadi running DNA target.
- UV Transimmulator : untuk menvisualkan DNA setelah di loading atau running dalam DNA elektroforesis
- Toples supernatan : untuk tempat pembuangan supernatan.
- Saringan sampel : untuk menyaring benur udang.
- Tube eppendorf : untuk tempat sampel yang akan di ekstraksi.
- Rak mikrotube : untuk tempat mikrotube.
- Yellow tip : untuk dipasangkan dengan mikropipet yang memiliki kapasitas volume 5-10 µl dan memiliki tingkat ketelitian hingga 0,05 µl.
- Refraktometer : untuk alat ukur salinitas perairan.
- pH meter : untuk alat ukur pH perairan.
- DO meter : untuk alat ukur DO perairan.

BAHAN
Bahan-bahan yang digunakan untuk pengamatan histopatologi ikan antara lain (Lampiran 7):
- Akuades : sebagai pemudar warna.
- Kantong plastik : sebagai tempat sampel udang.
GT buffer : sebagai penjaga struktur DNA selama proses
Penghancuran dan purifikasi sehingga memudahkan penghilangan protein dan  RNA.
- Bubuk agarose : sebagai bahan pembuat gel agarose.
- Larutan TBE : sebagai perendaman  gel agarose selama proses elektroforesis.
- Nuclease free water : sebagai pelarut.
- Sarung tangan : sebagai pelindung tangan.
- Alkohol 70 % : sebagai peluruh lemak dan protein.
- Larutan Etbr : sebagai bahan yang digunakan untuk
memvisualisasi potongan-potongan DNA selama   proses elektroforesis
- Tisue : sebagai pembersih sisa larutan
- Marker : sebagai bahan yang berfungsi untuk mengetahui Ukuran DNA hasil amplifikasi

SARANA DAN PRASARANA LABORATORIUM MANAJEMEN KESEHATAN HEWAN AKUSTIK (MKHA)
Selain didukung tenaga kerja yang cekatan dan professional. Laboratorium MKHA BBPBAP Jepara juga didukung sarana dan prasarana yang memadai.

SARANA LABORATORIUM MKHA
Adapun sarana yang dalam menunjang kegiatan di Laboratorium MKHA meliputi :
- Laboratorium Mikrobiologi, berfungsi sebagai ruang untuk mengamati, menganalisa dan menguji kasus-kasus penyakit yang diakibatkan oleh penyakit backterial, seperti bakteri Vibrio.
- Laboratorium Biologi Molekuler, berfungsi sebagai ruang untuk mengamati, menganalisa dan menguji kasus-kasus penyakit ikan/udang yang diakibatkan oleh penyakit viral seperti WSSV, TSV, IMNV, IHHNV, VNN, YHV, KHV, MBV, MrNV dan Iridovirus.
- Laboratorium Parasit, berfungsi sebagai ruang untuk mengamati, menganalisa dan menguji kasus-kasus penyakit yang diakibatkan oleh parasit seperti cacing, caligus dan lain-lain.
- Laboratorium Histopatologi, berfungsi sebagai ruang untuk mengamati, menganalisa dan menguji kasus-kasus penyakit yang diakibatnya terhadap kerusakan jaringan.
- Laboratorium Basah, berfungsi sebagai tempat memelihara sisa ikan yang tidak diisolasi.
- Ruang kepala laboratorium, berfungsi sebagai tempat kepala laboratorium menjalankan tugasnya.
- Ruang penerimaan contoh, berfungsi sebagai tempat penerimaan sampel dari pelanggan.
- Ruang administrasi, berfungsi sebagai tempat pembuatan dokumen administrasi.
- Laboratorium Bahan, berfungsi sebagai tempat menyimpan bahan-bahan yang akan digunakan pada kegiatan laboratorium, dan
- Tempat parkir, berfungsi sebagai tempat memakirkan kendaraan pegawai/tamu.

PRASARANA LABORATORIUM MKHA
BBPBAP Jepara memiliki prasarana yang mendukung tugas pelaksana. Prasarana tersebut antara lain kendaraan bermotor roda 2 sebanyak 6 buah dan kendaraan bermotor roda 4 sebanyak 1 buah, wifi sebanyak 1 buah, laptop sebanyak 7 buah.

PEMELIHARAAN UDANG VANAME

PENCEGAHAN PENYAKIT WSSV
Menurut Kurniawan dan Tompo (2013), serangan WSSV terjadi saat musim pancaroba yaitu pada bulan Oktober dan Mei. Dan prevalensi tinggi kejadian serangan virus WSSV terjadi pada musim penghujan dan pancaroba yaitu pada bulan Desember dan bulan Mei. Jika dikaitkan antara pola keberadaan virus WSSV di saluran pertambakan dengan bulan dan musim, nampak bahwa virus WSSV akan muncul pada masa pancaroba menuju musim penghujan dan pada akhir musim hujan. Secara umum kondisi kualitas air di perairan pada saat musim hujan, cenderung tidak stabil dan berfluktuasi, serta pada kondisi ekstrim akan terjadi penurunan kualitas perairan secara drastis. Pada kondisi hujan yang tinggi dapat menurunkan kadar salinitas air, kadar pH, dan kadar DO dalam air. Keadaan ini dapat memicu plankton untuk turun ke dasar perairan dan mengalami pembusukan. Pembusukan dapat meningkatkan kadar amonia, yang menjadi racun bagi organisme air. Rentetan alami tersebut dapat menjadi stressor alami yang efektif dan dapat menurunkan sistem kekebalan tubuh udang vaname.

Aplikasi probiotik pada BBPBAP jepara dari strain Bacillus sp. dengan dosis 0,5 ppm diberikan setiap 1 minggu sekali guna menaikan sistem imun tubuh. Probiotik dari jenis Bacillus yang diberikan adalah probiotik pabrikan dengan merk dagang Pro1. Tujuan aplikasi probiotik ini adalah untuk meningkatkan sistem kekebalan tubuh udang dan mendominasi bakteri dalam lingkungan air sehingga memperbaiki kualitas perairan. Hal ini sesuai dengan pendapat Moriarty et al. (2006), yaitu penambahan probiotik dari jenis Bacillus dapat meningkatkan sistem kekebalan tubuh udang serta memperbaiki kualitas air kolam budidaya.

PENGUKURAN KUALITAS AIR
Pengelolaan kualitas air adalah upaya pemeliharaan air sehingga tercapai kualitas air yang diinginkan sesuai peruntukannya untuk menjamin agar kondisi air tetap dalam kondisi alamiahnya. Kualitas air adalah kondisi kualitatif air yang diukur dan atau di uji berdasarkan parameter-parameter tertentu dan metode tertentu. Dalam budidaya domestikasi udang putih, untuk mengetahui fluktuasi kualitas air pada tambak petak Bandengan BBPBAP Jepara dilengkapi dengan berbagai peralatan uji kualitas air yang digunakan sebagai pengontrol air tambak setiap harinya. Peralatan tersebut meliputi pH-meter yang digunakan untuk mengukur kadar pH perairan. Selain itu juga digunakan DO meter untuk mengetahui kadar DO yang juga dikombinasikan dengan thermometer untuk mengukur suhu perairan serta refraktometer yang digunakan untuk mengukur salinitas perairan. Untuk pengukuran kandungan alkalinitas, amoniak, nitrit dan nitrat dilakukan setiap minggu melalui Laboratorium Fisika dan Kimia Air. Alat yang digunakan dalam pengamatan kualitas air pada tambak petak Bandengan BBPBAP Jepara dapat dilihat pada Gambar 3.

(a)

(b)

(c)

Gambar 3. (a) DO-meter, (b) pH-meter, (c) Refraktometer

Pada kegiatan pemeliharaan udang vaname di lokasi Praktik Kerja Magang (PKM) yaitu BBPBAP Jepara lokasi bandengan dilakukan pengontrolan kualitas air sebanyak dua kali dalam sehari yaitu pada pagi hari pukul 05.30 WIB dan sore pukul 16.00 WIB karena dalam waktu tersebut pagi dikarenakan belum terpengaruh sinar matahari dan sore hari dikarenakan puncaknya reaksi kimia matahari. Pola perubahan suhu perairan menunjukkan fluktuasi nilainya pada jam: 05.30; 12.00; dan 16.00 (Muarif, 2015). Menurut Boyd (2015) radiasi matahari, suhu udara, cuaca, dan iklim akan mempengaruhi besarnya suhu perairan. Penyebabnya dikarenakan pada pagi hari temperatur perairan masih dipengaruhi oleh temperatur udara malam hari, sedangkan temperatur pada siang hari mulai naik karena dipengaruhi oleh penyinaran dari matahari dan pada puncak terjadi pada sore hari karena air masih menyimpan panas dari penyinaran matahari di sepanjang hari (Rompas, 2002). Kualitas air berkaitan erat dengan kondisi kesehatan udang karena kualitas air yang baik mampu mendukung pertumbuhan secara optimal. Data hasil pengukuran kualitas air dapat dilihat pada Lampiran 3. Adapun parameter kualitas air yang diamati selama praktik meliputi suhu, pH, oksigen terlarut, dan salinitas.

SUHU
Pengamatan kisaran suhu di tambak pemeliharaan induk udang vaname di tambak Bandengan BBPBAP Jepara dilakukan pada pukul 05.30 dan 16.00 WIB. Nilai suhu menunjukkan nilai dalam kisaran optimal, yaitu berkisar antara 27,70C sampai 320C. Hal ini didukung oleh pendapat Haliman dan Adijaya (2005), bahwa suhu yang optimal untuk pertumbuhan udang antara 26-320C. Jarak suhu terendah dan tertinggi tidak terlalu tinggi karena kedalaman tambak yang relatif stabil dan mencapai ketinggian yang diharapkan sehingga fluktuasi suhu tidak terlalu berfluktuatif walaupun dalam kondisi cuaca hujan. Pengukuran suhu menggunakan alat DO meter yang didalamnya dapat menggukur nilai suhu sekaligus, dapat dilihat pada Gambar 4 dan hasil data pengukuran suhu pada setiap petakan tambak dapat dilihat pada Lampiran 3.



Gambar 4. Pengukuran Suhu Air dengan DO meter

PH
Berdasarkan hasil pengukuran pH di tambak pemeliharaan udang vaname di Bandengan BBPBAP Jepara berkisar antara 7,6 sampai 8,4. Hal ini sesuai dengan pendapat Sumeru dan Anna (1992), bahwa pH air yang baik untuk pemeliharaan dan pembesaran udang adalah 7,0-8,5. Berdasarkan data hasil pengukuran pH harian di lapangan, pH dalam kisaran normal, hal ini terjadi karena sebelum pengisian air sudah dilakukan penebaran kapur pada petakan untuk menstabilkan pH, jadi pH air sudah stabil sebelum penebaran udang vaname.

Menurut Widigdo (2013), proses fotosintesis di perairan memanfaatkan CO2 (karbondioksida) terlarut sehingga mengubah sistem kesetimbangan HCO3 - CO2 dan hidrolisasi yang ada. Kondisi yang demikian ini akan meningkatkan pH perairan. Pada malam hari fotosintesis tidak terjadi, sementara respirasi yang menghasilkan CO2 tetap berlangsung sehingga terjadi penambahan CO2 dalam perairan. Penambahan CO2 ini dapat menurunkan pH perairan menjadi lebih masam. Dengan demikian, setiap hari terjadi fluktuasi pH akibat proses respirasi dan fotosintesis. Nilai pH 7 dikatakan netral, lebih besar dari 7 adalah basa dan lebih kecil dari 7 adalah asam. Pengukuran pH menggunakan alat pH meter, dapat dilihat pada Gambar 5 dan hasil data pengukuran suhu pada setiap petakan tambak dapat dilihat pada Lampiran 3.



Gambar 5. Pengukuran pH dengan pH-meter

OKSIGEN TERLARUT (DISSOLVED OXYGEN)
Pengukuran DO dilakukan untuk mengetahui perubahan DO selama pemeliharaan berlangsung karena merupakan salah satu parameter kualitas air yang sangat diperlukan bagi kehidupan udang. Pengelolaan konsentrasi oksigen yang baik merupakan hal yang penting dilakukan untuk menunjang keberhasilan budidaya udang.

Berdasarkan hasil pengamatan oksigen terlarut di tambak pemeliharaan induk udang vaname di tambak Bandengan BBPBAP Jepara, memiliki fluktuasi nilai oksigen terlarut pada pagi hari yang berkisar antara 4,8 sampai 7,6 ppm dan pada sore hari berkisar antara 5,65-9,89 ppm. Hal ini masih dikatakan layak oleh Amri dan Kanna (2008), bahwa oksigen yang baik untuk pertumbuhan udang adalah 4-7 ppm.

Kisaran DO rendah biasanya terlihat pada malam hari sampai pagi hari karena terjadi kompetisi penggunaan oksigen antara udang, fitoplankton dan mikroorganisme yang ada dalam perairan. Sedangkan pada siang hari kondisi oksigen cukup tersedia karena tersuplai dari hasil fotosintesis plankton, kincir air, pompa air dan difusi dari udara sehingga pada siang hingga sore hari DO akan cenderung tinggi. Hal ini sesuai dengan pendapat Widigdo (2013) yang menyatakan bahwa, sumber utama oksigen terlarut dalam air adalah proses fotosintesis dari fitoplankton yang ada di dalamnya. Pemasangan kincir air (paddle wheel) tiap petakannya yang sesuai dengan kebutuhan udang juga membantu dalam kebutuhan oksigen. Berikut merupakan pengukuran oksigen terlarut menggunakan DO-meter seperti yang disajikan pada Gambar 6. Dan hasil pengukuran DO pada setiap petakan tambak dapat dilihat pada Lampiran 3.




Gambar 6. Pengukuran DO menggunakan DO-Meter


SALINITAS
Salinitas adalah jumlah kadar garam yang terkandung dalam suatu perairan dan dinyatakan dalam parts per thousand (ppt) atau o⁄oo. Salinitas masing-masing tambak berbeda-beda pada setiap tambak. Salinitas air tambak di tambak Bandengan BBPBAP Jepara yang teramati berkisar antara 27,3 sampai 32,9 o⁄oo. Perbedaan salinitas ini terjadi karena waktu proses pengisian air awal berbeda-beda sehingga salinitas tambak dipengaruhi oleh salinitas air laut pada saat pemasukan air. Salinitas air tambak ini sudah sesuai dengan kebutuhan udang untuk tumbuh dan berkembang. Selain itu juga pernyataan terebut diperkuat oleh pernyataan Haliman dan Adijaya (2005) yaitu udang merupakan spesies yang toleran terhadap salinitas dan dapat hidup pada rentang salinitas 15 – 45 o⁄oo. Dengan demikian, salinitas tidak menjadi masalah selama budidaya berlangsung. Pengukuran salinitas air tambak menggunakan alat refraktometer seperti yang disajikan pada Gambar 7 dan hasil pengukuran salinitas setiap petakan tambak dapat dilihat pada Lampiran 3.



Gambar 7. Pengukuran Salinitas dengan Refraktometer

SAMPLING PANJANG DAN BERAT UDANG VANAME
Sampling induk udang vaname di tambak Bandengan BBPBAP Jepara dilakukan setiap satu minggu sekali yakni pada hari Kamis. Sampling dilakukan pada satu titik agar udang tidak mengalami stress dan berpengaruh pada nafsu makan udang putih (Litopenaeus vannamei). Sampling dilakukan dengan cara jala ditebar ke petak pemeliharaan induk udang yaitu B5 kemudian udang yang sudah terjerat di jala diambil dan dimasukkan ke dalam bak yang sudah diisi dengan air terlebih dahulu. Selanjutnya diambil beberapa sampel udang vaname (Litopenaeus vannamei) jantan dan betina dan kemudian ditimbang menggunakan timbangan digital serta diukur panjang total dimulai dari rostrum hingga telson. Tujuan sampling udang ini antara lain untuk mengetahui berat rata-rata udang per ekor, untuk mengetahui kondisi kesehatan udang, serta untuk mengetahui kondisi dasar petakan yang digunakan selama proses pemeliharaan udang. Sampling dilakukan setiap minggu pada hari kamis. Seperti yang dikemukakan oleh Handajani dan Widodo (2010), untuk mengetahui pertumbuhan dan sintasan udang serta jumlah pakan yang akan di berikan maka dilakukan sampling panjang dan berat tubuh udang. Sampling sebaiknya dilakukan satu minggu sekali. Selama praktik kerja magang, telah dilakukan sampling sebanyak 4 kali. Cara sampling induk udang putih dapat dilihat pada gambar 8. Hasil sampling udang yang diperoleh selama praktik kerja magang dapat dilihat pada Lampiran 4.

(a)

                                                               (b)

Gambar 8 . (a) Pengambilan Sampel Udang  (b) sampel udang yang diukur

TEKNIK PCR
Uji PCR ini dilakukan dengan tujuan yaitu pada BBPBAP Jepara menghasilkan induk yang SPF (Specific Pathogen Free). Uji PCR ini digunakan untuk mendeteksi WSSV (White Spot Syndrome Virus). Primer yang digunakan disesuaikan dengan The Office International des Epizooties (OIE, 2009) yaitu menggunakan primer 146F (5’-GTA-ACTGCC-CC-TCC-ATC-TCC-A-3’) dan 146R (5’-TAC-GGC-ACG-TGC-TGC-ACC-TTG-T-3’) dan memiliki target 941 bp. Skema pemeriksaan WSSV dengan metode PCR adalah sebagai berikut (Lampiran 2).

PENGAMBILAN SAMPEL
Sampel udang vaname diambil secara random sampling oleh petugas yang berasal dari salah satu lokasi tambak di Balai Besar Perikanan Budidaya Air Payau Jepara. Kemudian sampel diserahkan pada bagian administrasi dan diisi form pengajuan analisa serta diberi kode sampel. Bagian administrasi melapor kepada manajer teknis yang nantinya akan menugaskan analis untuk melakukan pengujian. Deteksi penyakit WSSV (White Spot Syndrome Virus) dengan menggunakan metode PCR (Polymerase Chain Reaction) yang dilakukan di Laboratorium Biologi Molekuler, BBPBAP Jepara. Sampel benur udang vaname, sampel udang ukuran sedang dan sampel induk terdapat pada gambar 9.

(a)

(b)

(c)
               
Gambar 9. (a) benur vaname, (b) udang ukuran sedang, (c) induk vaname (Dokumentasi Laboratorium Biomolekuler BBPBAP Jepara, 2018)

STERILISASI PERALATAN
Sterilisasi merupakan suatu prosedur untuk membebaskan suatu bahan atau benda dari semua bentuk kehidupan. Proses yang digunakan untuk mematikan semua organisme yang terdapat pada suatu benda. Sterilisasi peralatan dilakukan dalam proses pengujian, terutama sterilisasi secara fisik, yaitu melalui pemanasan. Sterilisasi bertujuan untuk mensterilkan peralatan dari hal-hal yang dapat mengkontaminasi (Dwidjoseputro, 1994).

Pada proses sterilisasi alat yang akan digunakan disterilkan terlebih dahulu menggunakan autoklaf. Alat-alat seperti mikrotube 0.2 ml, 0.5 ml dan 1.5 ml serta pellet pastle dimasukkan terlebih dahulu ke dalam plastik. Sedangkan untuk tip 0.5 - 20 µl, 1 – 200 µl, 20 – 1000 µl diatur sedemikian rupa di dalam tempat mikrotip lalu dibungkus dengan plastik sebelum dimasukkan ke dalam autoklaf. Menurut Dwidjoseputro (1994), sterilisasi alat dan bahan pada suhu 121°C selama 15 menit dengan tekanan 1 atm. Setelah proses sterilisasi selesai, autoklaf didiamkan hingga tekanannya menjadi 0 atm. Sterilisasi juga dilakukan pada saat proses ekstraksi sampel. Peralatan yang sering digunakan pada proses ekstraksi sampel diantaranya adalah gunting dan pinset. Kedua peralatan tersebut dicelupkan ke dalam alkohol 70% setelah itu dibakar ujung hingga setengah bagiannya dengan api bunsen dan dibiarkan hingga api padam.

Peralatan yang telah disterilkan kemudian dikeluarkan dan dikeringkan dalam incubator dengan pengaturan suhu 80° selama 1 jam. Hal tersebut dimaksudkan agar uap air yang terdapat di dalam peralatan dapat cepat kering serta terhindar dari kontaminasi terhadap peralatan yang lain. Kemudian peralatan tersebut disimpan di dalam lemari steril. Proses sterilisasi peralatan dapat dilihat pada Gambar 10.

(a)

(b)
                                                 
Gambar 10. (a) Sterilisasi autoclave, (b) peralatan steril Preparasi Sampel

Sebelum memulai proses ekstraksi DNA dilakukan preparasi sampel terlebih dahulu. Agar terhindar dari kontaminasi terhadap sampel, maka gunting dan pinset yang akan digunakan untuk ekstraksi dibakar dengan alkohol 70% di atas api bunsen selama beberapa menit agar peralatan tersebut steril. Dalam melakukan preparasi sampel semua peralatan harus dalam kondisi steril, agar pada saat ekstraksi tidak terjadi kontaminasi dari lingkungan luar. Organ target yang diambil dari sampel udang vaname adalah kaki renang. Untuk pengambilan organ target pada sampel seringkali dipilih kaki renang ataupun insang. Sedangkan untuk sampel yang berupa benur dikarenakan ukurannya yang terlalu kecil, maka proses ekstraksi dilakukan dengan cara menghaluskan atau menggerus seluruh bagian tubuhnya.

Menurut Hidayani, et al. (2015), pengambilan kaki renang dan insang dilakukan dengan memotong organ tersebut secara langsung. Kaki renang merupakan salah satu organ yang tersusun dari sel epitel subkutikular, salah satu jaringan target WSSV. Sel epitel kutikular merupakan salah satu lokasi yang paling disukai WSSV dan dapat menjadi lokasi pertama masuknya virus. Pemisahan organ yang digunakan dilakukan secara aseptik dan dimasukkan ke dalam botol yang telah diisi larutan ethanol.

Pada proses ekstraksi sampel harus menggunakan tempat dan alat yang berbeda. Hal ini dimaksudkan agar terhindar dari kontaminasi silang DNA virus. Organ sampel yang akan digunakan dimasukkan ke dalam mikrotube yang sudah diberi label sesuai kode laboratorium. Kemudian sisa sampel yang tidak digunakan untuk ekstraksi dibungkus dengan alumunium foil dan dimasukkan ke dalam plastik (jika berupa benur) atau jika sampel berukuran sedang bisa langsung dimasukkan ke dalam plastik. Plastik bagian luar diberi kode sampel beserta tanggal pengujian. Hal ini dimaksudkan untuk verifikasi apabila terjadi kesalahan dalam pengujian. Proses preparasi sampel dapat dilihat pada Gambar 11.

(a)



Gambar 11. (a) sampel dihaluskan memakai gunting, (b) Proses penggerusan sampel memakai pellet pastel


EKSTRAKSI DNA
Ekstraksi DNA merupakan suatu proses untuk menghasilkan DNA template atau cetakan DNA dengan cara menggerus organ target dengan bantuan bahan yang mampu untuk melisiskan organ target (Surfianti, et al., 2010).

Organ target yang biasa digunakan dalam ekstraksi DNA udang adalah insang atau kaki renang (pleopoda). Ekstraksi DNA dapat dilakukan dengan berbagai metode, tergantung dari acuan yang digunakan. Pada Laboratorium Pengujian Mutu Perikanan Budidaya BBPBAP Jepara mengacu pada The Office International des Epizooties, OIE (2009) tentang Manual of Diagnostics Test for Aquatic Animal chapter 2.2.2, sehingga metode ekstraksi DNA menggunakan metode lisis buffer.

Menurut Handoyo (2001), dalam proses ekstraksi DNA bertujuan untuk mengeluarkan DNA dari nukleus, mitokondria, atau organel dan biasanya dilakukan dengan penambahan lisis buffer untuk mencegah terjadinya kerusakan DNA. Pada saat ekstraksi DNA dilakukan penumbukan sampel agar bahan sampel menjadi halus dan komposisinya menyatu. Pada dasarnya ekstraksi DNA terdiri dari beberapa tahap, yaitu : homogenisasi, separasi, presipitasi, pencucian dan pelarutan DNA. Ekstraksi pada organisme eukariot dilakukan melalui proses penghancuran dinding sel, penghilangan protein dan RNA, dan pengendapan DNA dan pemanenan.

Tahap pertama dalam melakukan ekstraksi DNA adalah homogenisasi. Proses homogenisasi dimaksudkan untuk menyatukan komponen-komponen dalam supernatant sesuai dengan fraksi berat komponen untuk mendapatkan DNA template. Proses homogenisasi dilakukan dengan cara apabila udang vaname berukuran benur maka sampel harus disaring terlebih dahulu. Kemudian ditumbuk atau dihaluskan dengan menggunakan gunting dan pinset yang sudah disterilisasi. Sampel sebanyak dimasukkan ke dalam tabung eppendorf dan diberi kode sampel. Sama halnya dengan sampel yang berukuran sedang, setelah diambil bagian organ target yaitu insang atau kaki renang, sampel dimasukkan ke dalam tabung eppendorf dilakukan pemberian 500 µl Lisis Buffer. Sampel ditumbuk lagi dengan menggunakan pellet pastle pada tabung tersebut, hal ini dimaksudkan agar dalam proses penghancuran sel komposisinya menyatu, sehingga DNA dapat keluar. Selanjutnya sampel di vortex sebentar lalu disentrifugate dengan kecepatan 10.000 rpm selama 5 menit. Cairan bening atau supernatant dituangkan ke dalam wadah hingga hanya tersisa endapannya saja dan ditambahkan 500 µl larutan lisis buffer. Tujuan penambahan larutan lisis buffer atau penyangga adalah untuk mempertahankan pH dan juga untuk melisiskan sel dan membrane fosfolipid bilayer, karena sampel bersifat basa. Kemudian sampel diinkubasi di Heating Block pada suhu 95°C selama 10 menit. Perlakuan tersebut dimaksudkan untuk mendegradasi protein dan lipid yang terdapat di dalam sel. Proses penambahan lisis buffer dan inkubasi sampel dapat dilihat pada Gambar 12.

(a)

(b)

Gambar 12. (a) Penambahan larutan lisis buffer, (b) Proses inkubasi sampel

Jika sudah maka ditunggu hingga tube dalam keadaan dingin. Tahap kedua adalah separasi DNA, yaitu memisahkan DNA dari komponen pengganggu seperti protein, lemak, dll dengan cara sentrifugasi selama 10 menit.dengan kecepatan 10.000 rpm. Dalam penataan tube pada alat sentrifugasi harus dalam keadaan seimbang. Terdapat beberapa tube yang berisi aquades sebagai larutan penyeimbang sesuai dengan volume yang dibutuhkan. Hal ini dilakukan agar sentrifugasi berjalan sempurna.

Tahap ketiga dalam ekstraksi DNA berikutnya yaitu presipitasi sekaligus pencucian DNA. Presipitasi merupakan suatu proses koagulasi atau penggumpalan DNA yang larut dalam fase air menjadi padat. Hal yang perlu dilakukan mula-mula yaitu disiapkan tube baru dan diberi kode sesuai dengan kode sampel. Sampel yang sudah disentrifuse tadi kemudian diambil supernatant sebanyak 200 µl dan dipindahkan ke dalam tube baru tersebut. Sedangkan untuk presipitasi DNA dari fase air dengan cara ditambahkan 400 µl ethanol absolut (96%). Kemudian divortex hingga homogen dan disentrifuse lagi dengan kecepatan 10.000 rpm selama 5 menit. Presipitasi DNA tidak terlarut sebelum sentrifugasi membentuk pellet seperti gel pada dinding dan dasar mikrotube. Proses sentrifugasi dan proses vortex untuk menghomogenkan sampel dapat dilihat pada Gambar 13.

(a)

(b)

(c)
        
Gambar 13. (a) Tube penyeimbang sentrifugasi (b) Proses sentrifugasi, (c) Proses vortex untuk menghomogenkan sampel

Tahap keempat dalam proses ekstraksi DNA adalah pelarutan DNA dengan cara dibuang cairan atau supernatant yang berada dalam tube sebelumnya hingga tersisa endapan pellet saja dan kemudian dikeringkan dengan cara membuka tube tersebut selama 10 menit. Pada saat dikeringkan tube dalam posisi terbalik dan berada di atas kertas tissue. Proses pembuangan supernatant dan pengeringan sampel dapat dilihat pada Gambar 14.

(a)

(b)

Gambar 14. (a) Supernatant dibuang, (b) Tube dibalik

Jika sudah kering maka dilarutkan dengan nuclease free water 25 µl, dengan tujuan untuk menghilangkan zat-zat yang tidak diinginkan pada sampel dan juga untuk meningkatkan pelarutan DNA sehingga bahan yang digunakan dapat lebih mudah hancur dan mempermudah prosesnya (Hossain, 2001). Sampel pada tube divortex sebentar hingga larutan nampak homogen. Setelah itu disiapkan mikrotube, dengan diberi label sesuai kode sampel. sampel yang berada dalam tube diambil sebanyak 1 - 2 µl dan dipindahkan ke mikrotube tersebut.

Menurut Koesharyani, et al. (2015) faktor-faktor yang mempengaruhi ekstraksi DNA biasanya tergantung pada kecepatan ekstraksi dan komposisi penambahan lisis buffer yang digunakan saat ekstraksi. Proses ekstraksi DNA dari sel adalah langkah pertama dalam prosedur pemisahan DNA dan substansi lain yang tidak diinginkan dengan sangat hati-hati sehingga tidak menyebabkan kerusakan DNA.

AMPLIFIKASI
Amplifikasi DNA merupakan proses penggandaan DNA template dengan bantuan enzim dan primer serta suhu yang sudah diatur sehingga diperoleh sejumlah DNA tertentu. Amplifikasi atau perbanyakan DNA target bertujuan meningkatkan jumlah DNA virus yang ada sehingga dapat dideteksi dengan elektroforesis. Amplifikasi harus dikerjakan secara aseptis di dalam laboratorium yang terkontrol dan memerlukan alat laboratorium yang khusus, seperti thermal cycler (Hidayani, 2015). Jika sudah dilakukan amplifikasi maka dapat menghasilkan perbanyakan DNA target yang lebih akurat, cepat dan spesifik, serta tidak memerlukan jumlah sampel yang banyak. Pada proses amplifikasi DNA terdapat 5 tahap, yaitu pre-denaturation, denaturation, annealing, extension dan extra extension.

Adapun komponen-komponen yang diperlukan untuk amplifikasi DNA adalah sebagai berikut :     
a) (Deoxyribonuleotide triphosphate) dNTP yang memberikan energy dan nukleosida untuk sintesis DNA
b) Enzym DNA Polymerase yang akan memanjangkan primer yang menempel pada cetakan. Biasanya digunakan Taq Polymerase yang tahan terhadap suhu tinggi
c) Magnesium chlorida (MgCl2) yang merupakan sumber trace element
d) Larutan PCR Buffer
e) Sepasang primer yang terdiri dari F (forward) dan R (Reverse) yang akan menentukan urutan DNA yang disintesis
f) Template yaitu DNA target yang diekstraksi dari sampel udang dan berfungsi sebagai cetakan DNA yang diperbanyak (amplifikasi)

Dalam pembuatan PCR Mix untuk deteksi virus WSSV yang dilakukan di Laboratorium Manajemen Kesehatan Hewan Akuatik BBPBAP Jepara yaitu dengan menggunakan Master Mix. Adapun Master Mix ini terdiri dari dNTP, enzim Taq Polymerase, MgCl2 dan larutan PCR buffer. Adapun komposisi master mix untuk deteksi WSSV yang digunakan dalam proses amplifikasi dibuat dengan mencampurkan bahan-bahan yang dilihat pada Tabel 1 berikut:

Tabel 1. Komposisi Master Mix
Komposisi master mix
Jumlah
DDW
15.875 µl
5x PCR Buffer
5 µl
MgCl2
1.5 µl
dNTP Mix
0.5
Primer 146-F
0.5 µl
Primer 146-R
0.5 µl
Taq DNA polymerase
0.125
Sampel DNA
1 µl
Total volume
25 µl

Apabila semua bahan telah dicampur, kecuali template DNA, kemudian dibagikan ke dalam mikrotube 0.2 ml dengan volume masing-masing 24 µl. Selanjutnya ditambahkan template DNA, termasuk kontrol negatif dan kontrol positif, kemudian di spin down. Prinsip kerja alat ini seperti mini centrifuge hanya saja tidak terdapat pengaturan waktu dan kecepatan. Selanjutnya, sampel dan kontrol yang telah homogen dimasukkan ke dalam mesin PCR atau thermal cycler dan diatur sesuai dengan pengujian yang akan dilakukan karena masing-masing virus memiliki syarat amplifikasi pengaturan suhu yang berbeda-beda.

Menurut Prayoga dan Wardani (2015), proses PCR berlangsung dalam tiga tahap, yakni tahap denaturasi, tahap penempelan (annealing), dan tahap pemanjangan (extension). Tahap denaturasi dilakukan dengan menaikkan suhu hingga suhu 93 – 950 C dan bertujuan untuk memecah DNA target dari dua untai menjadi untaian DNA tunggal yang saling terpisah. Tahap annealing dilakukan pada suhu 50 – 620 C setelah tahap denaturasi dan bertujuan agar primer menempel pada DNA target. Tahap extension berlangsung pada suhu 720 C setelah tahap annealing dan bertujuan agar enzim polimerase dapat melakukan sintesis sehingga berlangsung proses pemanjangan untaian DNA baru. Setiap tahap PCR tersebut harus dilakukan secara berurutan dan satu perjalanan dari tahap denaturasi hingga tahap extension dinamakan satu siklus (cycle). Satu proses PCR membutuhkan sekitar 30 – 40 siklus.


Adapun pengaturan suhu pada thermal cycler untuk deteksi WSS step 1 dapat dilihat pada Tabel 2 berikut :

Tabel 2. Pengaturan Suhu Thermal Cycler

No.
Reaksi
Temperature
Waktu
Jumlah Siklus
1.
Predenaturasi
950C
3 menit
1
2.
Denaturasi
950C
20 detik

3.
Annealing
620C
20 detik
40
4.
Extension
720C
30 detik

5.
Final Extension
720C
5 menit
1

Hold
40C
1

Pada dasarnya thermal cycler PCR untuk amplifikasi DNA virus memiliki prinsip yang sama, dimana terdiri dari 5 tahap yaitu pre-denaturation, denaturation, annealing, extension dan extra extension. Alat PCR memiliki prinsip memecah rantai ganda (double-stranded) menjadi rantai tunggal (single-stranded). Pemecahan rantai ganda menjadi tunggal memerlukan waktu 30 detik dan suhu tinggi 95°C proses ini disebut juga dengan denaturasi. Biasanya untuk beberapa produk master mix sebelum dimulai fase denaturasi, terdapat fase pre-denaturasi yang bertujuan untuk menstabilkan enzim-enzim yang berada dalam mastermix agar dapat bekerja secara optimal sebelum proses PCR dimulai.

Menurut Handoyo dan Rudiretna (2001), denaturasi merupakan proses yang penting dimana jika proses ini tidak lengkap kurang dari 30 detik akan menyebabkan renaturasi secara cepat, sedangkan waktu denaturasi yang terlalu lama dapat mempengaruhi kerja enzim taq polymerase dan mempengaruhi keberhasilan proses PCR. Penurunan suhu (annealing) merupakan pelekatan primer pada DNA unta tunggal pada suhu 55°C. Primer akan menempel pada pangkal (forward) dan ujung (reverse) masing-masing DNA tunggal. Dengan suhu yang tepat maka akan mengurangi kesalahan penempelan primer pada ujung 5’ dan 3’. Setelah proses penempelan primer selesai, maka diteruskan dengan extension atau pemanjangan primer yang telah menempel pada template suhu 72°C dengan bantuan enzyme polymerase (Taq Polymerase). Lama proses extention ditentukan oleh panjangnya DNA target yang akan dilipatgandakan dengan suhu yang digunakan karena Taq Polymerase tahan panas sampai suhu 100°C. Proses penempelan primer (annealing) merupakan penempelan primer pada DNA yang telah terbelah pada tempat yang spesifik. Bila suhunya dinaikkan lagi sampai 72°C, maka primer dengan bantuan enzim DNA polymerase akan membentuk untaian DNA sesuai dengan runtakan membentuk untaian DNA sesuai dengan urutan DNA yang terbelah, proses ini disebut dengan elongasi (extension). Adapun extra extension atau final elongasi berfungsi untuk penstabilan amplifikasi hasil PCR.

Proses denaturation, annealing dan extension akan terjadi pada siklus yang berulang 35 kali. Pada akhir reaksi akan terbentuk 2n DNA untai ganda, dimana n adalah jumlah ulangan siklus sekitar 108 - 109 kali dari jumlah DNA target awal. Extra extension pada suhu 72°C selama 7 menit untuk memberi kesempatan enzyme polymerase yang belum menyelesaikan reaksinya sehingga tidak ada sintesa DNA baru yang belum selesai. Setelah proses amplifikasi suhu 4°C atau pada freezer dengan pengaturan suhu -20°C atau dapat juga langsung digunakan untuk proses elektroforesis.

Dalam mendeteksi virus pada udang seperti White spot syndrome virus diperlukan teknik amplifikasi pada PCR. Analisis menggunakan PCR konvensional untuk pencegahan terjadinya false negatif dilakukan melalui pengecekan kualitas DNA/RNA hasil ekstraksi sampel udang menggunakan primer set. Pengecekan tersebut dilakukan sebelum DNA/RNA sampel tadi diamplifikasi menggunakan primer spesifik untuk virus yang diduga menginfeksi udang tersebut (Koesharyani, 2015). Proses penambahan larutan mix dan proses PCR pada Thermal Cycler dapat dilihat pada Gambar 15.

(a)

(b)

Gambar 15. (a) Penambahan larutan mix (b) Proses PCR pada Thermal Cycler

PEMBUATAN BUFFER TBE
Untuk membuat larutan buffer TBE dengan cara memasukkan 900 ml aquades dalam gelas beaker dengan kapasitas 1 liter. Kemudian siapkan Tris Base 100 ml dimasukkan dalam beaker yang berisi aquades dan dihomogenkan, buffer TBE ini dapat digunakan untuk merendam gel agarose selama proses elektroforesis.

Menurut Handoyo (2001), reaksi PCR hanya akan berlangsung pada kondisi pH tertentu. Oleh karena itu untuk melakukan proses PCR diperlukan buffer PCR. Fungsi buffer di sini adalah untuk menjamin pH medium. Selain buffer PCR diperlukan juga adanya ion Mg2+, ion tersebut berasal dari berasal MgCl2. MgCl2 bertindak sebagai kofaktor yang berfungsi menstimulasi aktivitas DNA polimerase. Dengan adanya MgCl2 ini akan meningkatkan interaksi primer dengan template yang membentuk komplek larut dengan dNTP (senyawa antara). Dalam proses PCR konsentrasi MgCl2 berpengaruh pada spesifisitas dan perolehan proses. Umumnya buffer PCR sudah mengandung senyawa MgCl2 yang diperlukan. Tetapi disarankan sebaiknya antara MgCl2 dan buffer PCR dipisahkan supaya dapat dengan mudah dilakukan variasi konsentrasi MgCl sesuai yang diperlukan. Larutan buffer TBE dapat dilihat pada Gambar 16.


Gambar 16. Buffer TBE

PEMBUATAN ETHIDIUM BROMIDE (10MG/ML)
Ethidium Bromide (EtBr) merupakan bahan yang digunakan untuk memvisualisasi potongan-potongan DNA selama proses elektroforesis. Hal ini terjadi karena EtBr dapat memendarkan sinar UV ketika disinari sinar UV Transilluminator, akan tampak citra berupa pita-pita pada gel yang merupakan molekul-molekul DNA yang bergerak sepanjang gel setelah dielektroforesis. Pada pembuatan larutan EtBr (10 mg/ml) dapat dibuat dengan cara menambahkan 1 gram Et Br dalam 100 ml aquades kemudian diaduk dengan magnetik stirrer beberapa jam sampai terlarut (Arafani, et al., 2016). Pembuatan Ethidium Bromide dapat dilihat pada Gambar 17.


Gambar 17. Pembuatan Ethidium bromide

PEMBUATAN GEL AGAROSE
Menurut Arafani, et aI. (2016), gel agarose dibuat dengan melarutkan suatu bahan agarose tersebut ke dalam larutan buffer. DI Laboratorium MKHA BBPBAP Jepara yang digunakan adalah gel agarose 1.5% yang dibuat dengan cara memasukkan 1.5 gram agarose dalam 100 ml larutan Tris Boric EDTA (TBE), kemudian dipanaskan dengan microwave oven sampai larutan menjadi bening atau homogen.

Setelah larutan agarose homogen, kemudian dihomogenkan hingga dingin dan suhunya turun sekitar 50°C - 70°C. Gel agarose ini dicetak dengan pencetak sumur (sisir) yang disesuaikan dengan jumlah sampel yang diuji. Hal yang perlu diperhatikan saat menuangkan gel agarose adalah menghindari adanya gelombang pada gel. Untuk cetakan kecil yang berisi 8 sampel dituangkan 15 ml gel agarose cair. Sedangkan untuk cetakan besar berisi 17 sampel dituangkan 30 ml gel agarose cair. Kemudian dibiarkan dingin selama 30 menit dan gel siap digunakan. Proses pembuatan gel agarose dapat dilihat pada Gambar 18.

(a)

(b)

Gambar 18. (a) bubuk agarose, (b) Pembuatan gel agarose

ELEKTROFORESIS 
Elektroforesis merupakan metode standar untuk separasi sebuah molekul besar, seperti protein, DNA, RNA dari campuran molekul yang serupa. Metode ini digunakan untuk memisahkan komponen atau molekul bermuatan berdasarkan perbedaan tingkat migrasinya dalam sebuah medan listrik. Jika molekul bermuatan negatif melalui suatu medium maka molekul akan bergerak dari muatan negatif menuju positif. Kecepatan gerak molekul tergantung pada rasio muatan terhadap massanya dan bentuk molekulnya (Handoyo, 2001).

Pada gel agarose yang siap digunakan ditambahkan larutan TBE ke dalam alat elektroforesis hingga gel agarose terendam. Sampel marker diambil sebanyak 2 µl kemudian disuntikkan ke dalam lubang sumur dengan hati-hati pada lubang pertama lalu 5 µl kontrol positif disuntikan pada lubang sumur kedua dan 5 µl kontrol negatif disuntikan ke lubang sumur ketiga, dilanjutkan dengan penyuntikan sampel sebanyak 5 µl ke lubang sumur berikutnya . Setelah semua sampel disuntikkan, kemudian memasang tutup elektroforesis dan menghidupkan listrik dengan voltase diatur 150 V.

PEWARNAAN DNA
Perpendaran pita-pita DNA akan diamati dalam UV Transilluminator dan penentuan ukuran fragmen dilakukan dengan cara membandingkan mobilitas atau kecepatan pergerakan fragmen dengan DNA standar yang telah diketahui dalam kontrol positifnya. Visualisasi DNA lebih mudah menggunakan bahan kimia yang dapat berpendar pada sinar terutama sinar UV. Oleh karena itu bahan kimia yang dipakai adalah larutan Ethidium Bromida (EtBr), karena sifatnya yang karsinogenik, penggunaan dan penyimpanan larutan EtBr harus bersifat hati-hati. Pewarnaan dilakukan dengan perendaman dalam larutan EtBr selama 5-10 menit.     

Ethidium Bromide akan berinteraksi dengan basa dari molekul DNA dan akan memberikan warna orange fluoresance yang dapat dilihat di bawah sinar ultraviolet. Untuk menghilangkan kandungan background EtBr yang masih tersisa pada gel agarose, maka dilakukan perendaman gel agarose tersebut pada aquades steril selama 15 menit (Arafani, 2016). Proses pewarnaan DNA dapat dilihat pada Gambar 19.

Gambar 19. Larutan pewarna EtBr

PEMBACAAN HASIL
Pengamatan hasil elektroforesis dengan melalui pewarnaan gel yang akan berpendar apabila dilihat dengan menggunakan sinar ultraviolet. Agarose yang telah digunakan untuk proses elektroforesis diangkat pelan-pelan dengan menggunakan spatula ke dalam UV Transilluminator. Selanjutnya hasil yang telah diperoleh tersebut diamati kemudian diatur pencahayaannya, dekat, jauh dengan menggunakan lensa kamera yang berada di UV Transilluminator. Apabila band sampel sejajar pada kontrol positif maka dimungkinkan sampel terinfeksi penyakit WSSV dan apabila band sampel tidak sejajar dengan kontrol positif atau sejajar dengan kontrol negatif maka sampel tersebut tidak terinfeksi penyakit WSSV. Hasil yang diperoleh didokumentasikan dan dicetak dengan digital foto sistem yang digunakan untuk laporan hasil pemeriksaan PCR. Menurut Handoyo (2001), langkah dalam pembacaan hasil elektroforesis diantaranya :
1. Gel agarose direndam dalam laruan Ethidium Bromide (5 µg/ml) selama 5 menit
2. Kemudian gel agarose direndam dalam akuades selama 15 menit untuk menghentikan proses pewarnaan
3. Hasil positif WSS bila terlihat perpendaran pita DNA dengan ukuran 941 bp
4. Hasil negatif apabila tidak terlihat perpendaran pita DNA dengan ukuran 941 bp
5. Mendokumentasikan hasil
Elektroforesis gel agarose merupakan metode yang banyak digunakan untuk pemisahan protein, DNA dan RNA. Molekul asam nukleat dipisahkan sesuai dengan ukurannya dengan menggunakan medan listrik, dimana molekul yang bermuatan negatif akan bermigrasi ke arah anoda (kutub positif). Urutan migrasi ini ditentukan oleh berat molekul, yang mana molekul dengan berat molekul kecil akan bermigrasi lebih cepat daripada molekul dengan berat molekul besar. Namun dapat pula digunakan sebagai teknik preparatif untuk memurnikan molekul sebelum digunakan dalam metode-metode lain seperti UV transilluminator. Hasil PCR dari sampel udang vaname dapat dilihat pada Lampiran 3.

Menurut Hidayani, et al. (2015), pembacaan hasil visualisasi hasil elektroforesis sesuai buku panduan memiliki tingkat infeksi yang terdiri dari sangat ringan, ringan sedang dan berat. Infeksi WSSV sangat patogenik pada kondisi udang yang diberikan tekanan, hal ini karena mekanisme pertahanan tubuh udang tidak dapat mencegah atau menahan perbanyakan WSSV di bawah kondisi stress. WSSV dapat menyebar dengan cepat ke berbagai organ seperti jantung, epidermis, otot maupun sistem pencernaan meski dalam jumlah yang kecil. Menurut Norizan et al (2017), pembacaan hasil PCR dapat dikatakan positif apabila lane sampel positif terinfeksi WSSV satu garis lurus dengan kontrol positif, apabila tidak satu garis lurus dinyatakan negatif WSSV. Proses pembacaan hasil elektroforesis dapat dilihat pada gambar 20. Hasil sampling udang yang diperoleh selama praktik kerja magang dapat dilihat pada Lampiran 5.

Gambar 20. Pembacaan hasil elektroforesis

KESIMPULAN DAN SARAN

KESIMPULAN
Adapun kesimpulan dari praktek kerja magang ini adalah deteksi WSSV pada udang vaname (Litopenaeus vannamei) dengan metode PCR di Balai Besar Perikanan Budiaya Air Payau diperoleh kesimpulan sebagai berikut:
• Teknik uji virus dengan menggunakan PCR adalah suatu teknik yang digunakan untuk mendeteksi adanya virus pada udang dari stadia naupli sampai dewasa dengan bantuan alat Thermal cycler
• Rangkaian kerja PCR terdiri dari ekstraksi, amplifikasi dan elektroforesis
• Kegiatan amplifikasi merupakan kegiatan inti dari uji PCR yaitu perbanyakan DNA target untuk meningkatkan DNA virus dengan Thermalcycler (mesin PCR) sehingga dapat dideteksi dengan elektroforesis, yang terdiri dari 3 prinsip kerja PCR yaitu Denaturation, Annealing dan Extention.
• Hasil dari Praktik Kerja Magang yang dilakukan di BBPBAP Jepara terhitung mulai tanggal 25 Juni hingga 10 Agustus di dapat total sampel yang menggunakan uji PCR  konvensional sebanyak 9 sampel negatif WSSV dan 1 sampel positif WSSV.

SARAN
Saran yang dapat diberikan yaitu sebaiknya pada saat penutupan mikrotube kegiatan ekstraksi sampel udang harus pas pada bagian ujung mikrotube dan harus sangat berhati-hati agar menghindari kemungkinan kontaminasi silang agar mendapatkan hasil uji PCR sesuai yang diharapkan.

PENULIS
Gery Purnomo Aji Sutrisno
FPIK Universitas Brawijaya Angkatan 2015

DAFTAR PUSTAKA
Amri, K. dan I. Kanna. 2008. Budi Daya Udang Vaname Secara Intensif, Semi Intensif, dan Tradisional. PT Gramedia Pustaka Utama. Jakarta. 168 hlm.

Arafani, L. Ghazali., M. Ali dan Muhamad. 2016. Pelacakan virus bercak putih pada udang vaname (Litopenaeus vannamei) di Lombok dengan real-time polymerase chain reaction. Jurnal Veteriner. 17(1): 88-95.
Bower SM. 1996. Synopsis of infection Disease and Parasites of commercially Exploited Shell fish : White Spot Syndrome of Panaeid Shrimp. http://www-sci.pac.dfo-mpo.Gc.ca.html/. Diakses pada tanggal 20 Agustus 2018.
Boyd, C.E. 2015. Water Quality. Switzerland: Springer.
Bray, W.A., A.L. Lawrence, and J.R. Leung-Trujillo. 1994. The effect of salinity on growth and survival of Penaeus vannamei, with observations on the interaction of IHHN virus and Salinity. Aquaculture, 122:133-146.     
Briggs, M., Smith, S.F., Subasinghe, R., & Phillips, M. 2004. Introduction and Movement of Penaeus vannamei and Penaeus stylirostis in Asia and the Pacific. RAP Publication 2004/10.
Brookes, A. J. 1999. The essence of SNP’s. Genes Dev. 234: 177-186.
Budiarto, B.R. 2015. Polymerase Chain Reaction (PCR) : Perkembangan dan Perannya dalam Diagnostik Kesehatan. BioTrends. 6(2): 29-38.
Burhanuddin. 2009. Riset Budidaya Udang Vaname (Litopenaeus vannamei) dengan Umur Tokolan Berbeda. Seminar Nasional Hasil Riset Kelautan dan Perikanan.
Direktorat Jenderal Perikanan Budidaya. 2013. Volume Produksi Udang 2009-2013. Departemen Kelautan dan Perikanan.
Haliman, R.W. dan D. S. Adijaya. 2005. Udang Vannamei, Pembudidayaan dan Pr Spek Pasar Udang Putih yang Tahan Penyakit. Jakarta: Penebar Swadaya. 75 hlm.
Handajani, H., dan W. Widodo. 2010. Nutrisi Ikan. Surabaya. Umm Press. 103 hlm.
Handoyo, D. dan A. Rudiretna. 2001. Prinsip umum dan pelaksanaan polymerase chain reaction (PCR). Jurnal Unitas. 9(1): 17-29.
Hossain, M. S., S.K. Otta, I. Karunasagar and I. Karunasagar. 2001. Detection of White spot syndrome virus (WSSV) in wild captured shrimp and in non-cultured crustaceans from shrimp ponds in Bangladesh by polymerase chain reaction. Journal Fish Pathology, 3(6): 93-95.
Hudi, L dan A. Shahab. 2005. Optimasi produktivitas budidaya udang vaname (Litopenaeus vannamei) dengan menggunakan metode respon surface dan non linear programming. Prosiding Seminar Nasional Manajemen Teknologi II. 28.1-28.9.
Kilawati,Y dan Y. Maimunah. 2015. Kualitas lingkungan tambak intensif Litopenaeus vannamei dalam kaitannya dengan prevalensi penyakit White spot syndrome virus. Research Journal of Life Science. 2(1): 50-59.
Koesharyani, I dan L. Gardenia. 2015. Metode deteksi cepat White spot syndrome virus (WSSV) dan infectiuos myonecrosis virus (IMNV) menggunakan portabel/mobile polymerase chain reaction. Jurnal Akuakultur. 10 (1): 43-49.
Kurniawan, K dan A. Tompo. 2013. Prevalensi dan Waktu  Infeksi White Spot Syndrome Virus (WSSV) pada Saluran Pertambakan di Kecamatan Sidayu Kabupaten Gresik dan Kecamatan Tanggulangin Kabupaten Sidoarjo. Prosiding Forum Inovasi Teknologi Akuakultur. 801-805.
Mahardika, K., Zafran dan I. Koesharyani. 2004. Deteksi White spot syndrome virus (WSSV) pada udang windu (Penaeus monodon) di Bali dan Jawa Timur menggunakan metode polymerase chain reaction (PCR). Jurnal Penelitian Perikanan Indonesia, 10(1): 55-60.
Manoppo, H. 2011. Peran Nukleotida sebagai Imunostimulan terhadap Respon Imun Nonspesifik dan Resistensi Udang Vaname (Litopenaeus vannamei). Skripsi. Bogor: IPB. Tidak dipublikasikan.
Moriarty, D. J. W, Decamp, O and Lavens, P. 2006. Probiotic in Aquaculture. Aqua Culture Asia Pacific Magazine. 89 hlm.
Muarif, 2016. Karakteristik Suhu Perairan di Kolam Budidaya Perikanan. Jurnal Mina Sains. 2(2): 96-101.
Nadhif, M. 2016. Pengaruh Pemberian Probiotik pada Pakan dalam Berbagai Konsentrasi terhadap Pertumbuhan dan Mortalitas Udang Vaname (Litopenaeus vannamei). Skripsi. Fakultas Sains dan Teknologi, Universitas Airlangga, Surabaya.
Norizan, N., F. S. Harrison., M. Hasan., N. Musa., N. Musa., M. E. A. Wahid., S. Catherine dan Zainathan. 2017. First detection of white spot syndrome virus (wssv) in wild mudcrab Scylla spp. (de Hann, 1883) from Setiu wetlands, Malaysia. Journal Science and Technology. 2-25
Prayoga, W dan A. K. Wardani. 2015. Polymerase Chain Reaction Untuk Deteksi Salmonella sp. Jurnal Pangan dan Agroindustri. 3(2): 483-488.
Purhantara. 2010. Metode Penelitian Kualitatif untuk Bisnis. Graha Ilmu: Yogyakarta. 178 hlm.
Rochman, 1995. Mengamati White spot secara Selular. Techner Edisii 18 (thIII/1995). Hal:7-9.
Sugiono. 2009. Metode Penelitian Bisnis. Alfabeta: Bandung. 540 hlm.
Sumeru, S. U., dan S. Anna. 1992. Pakan Udang Windu (Panaeus moonodon). Yogyakarta: Kanisius. 96 hlm
Suryabrata. 1991. Metodologi Penelitian. CV. Rajawali: Jakarta. 96 hlm.
Suyanto, S dan E. P. Takarina. 2009. Panduan Budidaya Udang Windu. Penebar Swadaya: Jakarta. 116 hlm.
Techner, 1995. Penyakit Ganas White Spot. Techner Edisi 18 (th III/1995). Hal:4-5.
Vlak, J. M., Bonami J. R., Flegel T. W., Kou G. H., Lightner D. V., LO, C. F., Loh P. C., Walker, P. J. 2002. http // www.plant Wageningen-urnl/dews/2001- 14-en/html. Diakses pada tanggal 18 Agustus 2018.
Wang, Y. G, Shariff, P. M. Sudha, P S. Srinivasa Rao., M. D. And L. T. Tan. 1998. Managing White Spot Disease in Shrimp. Info Fish International. 3/98. P:30-36.
Widigdo, B. 2013. Bertambak Udang Dengan Teknologi Biocrete.Jakarta: Kompas Media Nusantara.
Wijayanti, A., E. Susanti., C.purbomartono.1999. Pedoman Praktis Analisis Penyakit Udang. BBPBAP Jepara.
Wyban, J. W dan Sweeney, J. N. (1991). Intensive Shrimp Production Technology. The Oceanic Institute Shrimp Manual. Honolulu, Hawai, USA. 158 pages.
Yusuf, Z. K. 2010. Polymerase Chain Reaction (PCR). Jurnal Saintek. 5(6): 1-6.

LAMPIRAN

Lampiran 1. Pengelolaan sampel di Laboratorium MKHA BBPBAP Jepara

Lampiran 2. Skema pemeriksaan WSSV yang menyerang udang vannamei dengan metode PCR

Lampiran 3. Pengukuran kualitas air naupli udang vaname

Lampiran 3. (Lanjutan) pengukuran kualitas air udang vaname ukuran sedang

Lampiran 3. (Lanjutan) pengukuran kualitas air udang vaname ukuran indukan

Lampiran 4. Data Sampling Induk Udang Vaname (Litopenaeus vannamei)

Lampiran 5. Hasil PCR WSSV pada udang vannamei

Lampiran 6. Alat yang Digunakan

Lampiran 7. Bahan yang Digunakan

Lampiran 8. Uji PCR WSSV pada udang vaname

No comments:

Post a Comment