Darah Ikan; Film Darah, Pengambilan Darah (Fisiologi Hewan Air)

Menurut Kafilzadeh et al. (2013), sampel darah diambil dari vena caudal dengan jarum suntik heparinized. Selanjutnya darah ditransfer ke tabung mikro 1,5 ml. Sampel darah disentrifugasi (3000 rpm selama 10 menit) dan serum darah dipisahkan.

 

Darah dikumpulkan dari pembuluh vena pada sirip caudal dengan mengukur 23 jarum suntik plastik. Lapisan darah yang tipis dibuat dari darah yang dikumpulkan dengan cara mengoleskan/ menggeser cover glass yang diberi tetesan darah pada obyek glass secara searah . Darah yang telah dioleskan dibiarkan pada suhu ruangan dan kemudian diberi larutan methanol. Darah yang telah kering kemudian diteliti dengan memasangnya dalam mikroskop elektronik dengan perbesaran 10x40(Omeji et al.,2013).

 

Darah (0.1ml) diamati pada sebuah mikroskop kaca bebas lemak langkahnya yaitu dengan menggeser kaca penyebar ke darah yang diteteskan pada obyek glass. Untuk menghasilkan lapisan darah yang tipis, dibuat dengan mendorong kaca penyebar maju dengan cepat dan lancar. Ini dilakukan pada permukaan yang kering dan sejuk, agar mudah untuk mengeringkan darah. Kemudian ditetesi dengan methanol dan kemudian diwarnai dengan zat warna Field A dan B. Penggunaan mikroskop dilakukan pada pembesaran 10x, 40x (Arinze et al., 2014).

 

Film darah bias dilakukan pada semua ikan. Pada perlakuan film darah awalnya ikan disimpan di akuarium sampai benar-benar siap buat pengamatan.Untuk memperoleh ikan terinfeksi atau tidak diperlukan larutan methanol dan giemsa. Sampel darah diambil dari ikan yang terkena infeksi lalu sampel dicairkan pada suhu kamar. Selanjutnya diamati menggunakan mikroskop (Ferreira wt al.,2013).

 

MenurutCampbell (2015), sampel film darah setelah disiapkan harus segera dikeringkan. Tujuannya agar tidak persentuhan langsung dengan udara. Namun kelembapan juga diperlukan agar tidak terjadi pengeringan secara artefak karena akan merusak struktur sel. Sampel darah harus diberi label yaitu identifikasinya dan tanggalnya. Pemeriksaan  sampel darah bisa menggunakan perbesaran lensa 10-20 kali atau dengan 100 kali agar hasilnya terlihat apakah rendah atau tinggi.

 

Menurut Erhunmwunse (2013), setelah sampling, ikan ditempatkan kembali di tempat penampungan air tawaruntuk proses pemulihan. Setelah proses pengambilan sampel darah, sampel darah diproses menggunakan mikroskop.Langkah-langkah sebagai berikut: pada mikroskop cahaya, setelah sampel darah  di smear kemudian sampel darah ditetesi dengan metanol dan tunggu selama 3 menit pada suhu kamar atau dengan uap formalin pada 37 ° C selama 1 jam. Kemudian, diwarnai dengan 10% Giemsadi PBS, hematoxylin-eosin atau PAS. Sampeldarah kemudian diperiksa dandifoto di bawah mikroskop.

 

Proses pembuatan film darah pada ikan membutuhkan ketelitian. Ekstrak daun quince juga dapat membantu untuk mengembalikan struktur darah yang rusak. Pembuatan film darah dilakukan dengan metode smear. Saat darah diproyeksikan terihat permukaan darah tidak beraturan. Dalam hal ini, darah ikan lele (Clariasgariepinus) akan berubah eritrositnya jika terkena paparan sinar UVA(Sayed et al 2013).

 

Darah yang diambil pada saat pembuatan film darah dapat diambil darah dari caudal peduncle. Darah yang telah diteteskan pada object glass kemudian dilakukan metode smear. Setelah itu ditetesi larutan methanol, dan ditunggu kering selama 10 menit. Setelah itu diberi larutan giemsa pada object  yangakan diamati. Setelah diberi larutan giemsa amati pada mikroskop dengan perbesaran 10 kali(Sayed et al.,2015).

 

Antikoagulan darah  untuk  analisis  hematologi  harus diproses  dalam  waktu  yang  disarankan  (4  jam) untuk menghindari hasil yang mungkin tidak valid. Penelitian ini menegaskan bahwa, penyimpanan EDTA  sampel  darah  antikoagulan  pada  4  -  8⁰ C  selama  empat  hari  periode  (72hrs)  menyebabkan  beberapa perubahan yang luar biasa dalam  morfologi eritrosit serta kerapuhan osmotik mereka.  Dari temuan morfologi, film  tipis  yang disiapkanakan   bernoda  dalam  waktu  empat  jam  dari  koleksi  sampel  umumnya karena muncul normochromic normositik. Ini  menegaskan bahwa  analisis langsung sampel mengurangi perubahan dalam sampel yang dapat disalah artikan sebagai patologis temuan(Antwi-Baffour et al., 2014).

 

Menurut Shahi (2013), sample darahikan yang digunakan dapat diambildari caudal peduncle, dorsal aorta,anal, ventral, pectoral danlinealateralis . Kemudian sample darahikanleledumbo (Clariasgariepinus) diratakandenganmetode smear di atasobjek glass. Sebelum dilakukan metode smear, sample darah di homogenkan dengan larutan antikoagulanbuatan ( Na-sitrat, EDTA, Na Fisatau heparin) yang diletakkan di dalam tube dengan konsentrasi 1,5 ml. Metode film darah tipis memerlukan pengeringan dan fiksasi denganlarutan methanol. Objek glass dilumuri dengan larutan giemsa dan diamati di bawah mikroskop binokulerdengan perbesaran 100x di bawah lensa objektif.

 

Sampel darah yang telah disiapkan dengan metode smear untuk setiap perlakuan dibiarkan kering pada suhu ruang. Setelah kering difiksasi dengan metanol selama 5-8 menit. Selanjutnya diwarnai dengan pewarna giemsa. Pemeriksaan sampel darah dilakukan di bawah mikroskop (MagnusMLX-Tr, India) pada pembesaran 1000x. Kemudian didokumentasikan hasil pengamatan menggunakan kamera digital( Maqboo et al., 2014).

 

Menurut Brum et al.(2016), smear pada sampel darah dibuat rangkap dan diwarnai dengan May Grünwald-Giemsa Wright. Untuk koleksi sampel, diambil dari ikan pada masing-masing akuarium. Darah yang terkumpul disimpan semalam di 4 ° C selama koagulasi. Setelah darah menggumpal disentrifugasi pada 1400g selama 10 menit. serum aliquoted dan disimpan pada-20 ° C untuk analisis lebih lanjut. Sampel darah yang diperoleh dengan antikoagulan (untuk hemogram dan fagositosis) disimpan terpisah sedangkan sampel yang dikumpulkan tanpa antikoagulan, untuk koleksi serum.

 

Menurut Preston et al.(2013), Sampel darah disiapkan dengan mengambil darah pada pangkalekor. Kemudian darah yang telah diambil diteteskan pada slide kaca dengan metode smear. Sehingga memungkinkan terjadi pengeringan selama 10 menit sebelum difiksasi dengan 100% metanol. Kemudian sample darah ditetesi dengan  6% Giemsa. Kemudian diamati dibawah mikroskop dengan graticule 1 mm dan pada interval 1μm.

 

Hasil untuk analisis hematologi, hewan-hewan itu dibius dengan benzocaine (3%).Darah diambil padabagian ekor, dengan bantuan jarum suntik yang sebelumnya sudah sisterilisasi. Darah spesimen diuji untuk jumlah eritrosit (RBC), hematokrit (Ht) dan hemoglobin tingkat (Hb). Smear pada sampel darah  dibuat dengan menggunakan aliquots darah yang sama kemudian diwarnai dengan Giemsa. Pewarna Giemsa digunakan untuk menghitung jumlah total leukosit (WBC) dan untuk setiap jenis leukosit (Limfosit, neutrofil, basofil, eosinofil dan monosit) danjumlahtrombosit( Franca et al.,2013).

 

Menurut Prasad et al.(2013), Metode smear pada pewarnaan giemsa dibagi menjadi dua yaitu smear tebal dan tipis. Smear tipis digunakan untuk menilai tingkat infeksi. Spesimen diwarnai dengan Giemsa, yang menyatakan parasit dengan cara yang berbeda. Giemsa stain digunakan untuk membedakan morfologi sitoplasma, trombosit, sel darah merah, sel-sel darah putih dan parasit. Giemsa merupakan pewarnaan asam nukleat dan karena itu komponen-komponen yang mengandung asam nukleat, yaitu parasit, sel darah putih dan trombosit, yang disorot dalam warna ungu kebiruan. Sel darah merah biasanya berwarna sedikit merah muda. Cincin dari trofozoit memilikil warna biru pucat.

 

Publisher

Gery Purnomo Aji Sutrisno

FPIK Universitas Brawijaya Angkatan 2015

 

Daftar Pustaka

Antwi-Baffour,S., E. Quao, R. Kyeremeh, S.A. Mahmood.2014. Prolong storage of blood in EDTA has an effect on the morphology and osmotic fragility of erythrocytes. International Journal of Biomedical Science and Engineering. 1(2): 20-23.

Arinze,U., F. Sikokiand S.Nzeako. 2014. Endoparasitaemia of ChrysichthysNigrodigitatus in a Tidal Freshwater Body in the Niger Delta, Nigeria. International Journal of Scientific Research in Environmental Sciences. 2(7) : 250-260.

Brum, A., S.A. Pereira, M.S.Owatari, E.C.Chagas, F. C.M.Chaves, J.L. P.Mouriño and M. L. Martins. 2016. Effect of dietary essential oils of clove basil and ginger on Nile tilapia (Oreochromisniloticus) following challenge withStreptococcusagalactiae. Aquaculture 468 :235–243.

Campbell, T.W. 2015.Evaluation of the BloodFilm.Veterinary Clinics of North America: Exotic Animal Practice.18 (1) : 703 : 721.

Erhunmwunse, N.O and M.O. Ainerua. 2013. Characterization of some blood parameters of african catfish (Clariasgariepinus). American-Eurasian Journal of Toxicological Sciences. 5 (3): 72-76.

Ferreira, M.L. and A. Avenan_tOldewage 2013.Selected haematological changes in Clariasgariepinus(Burchell, 1822) infected with a Trypansosoma sp. from the Vaal Dam, South Africa.Onderstepoort Journal of Veterinary Research. 80(1) :572, 3 pages.

França,J. G., M. J. T. Ranzani-Paiva, J.V. Lombardi, S.D.Carvalho, F.Filipak-Neto and C.A. Oliveira-Ribeiro.2013.Toxic effect of potassium permanganate on Oreochromisniloticus based on hematologicalparameters and biomarkers of oxidative stress. International Journal of Fisheries and Aquaculture. 5( 1) : 1-6.

Kafilzadeh, R., S. Y. Mousavi and M. J. Baboli. 2013. Effects of Saccharomyces cerevisiae (Saccharomycetes: Saccharomycetaceae) on Astronotus ocellatus as growth promoter and immuno stimulant. International Journal of Bioflux Society.  6(6) : 587-598

Omeji, S., S.G. Solomon AndUloko, C. 2013. Comparative Study On The Endo-Parasitic Infestation In ClariasGariepinus Collected From Earthen And Concrete Ponds In Makurdi, Benue State, Nigeria.IOSR Journal of Agriculture and Veterinary Science (IOSR-JAVS). 2(1) : 45-49.

Prasad,K.,J.Winter, U.M.Bhat, R. V.Acharya and G.K.Prabhu. 2013. Image Analysis Approach for Development of a Decision Support System for Detection of Malaria Parasites in Thin Blood Smear Images. J Digit Imaging.25:542–549.

Preston, A. C., J. F. Taylor, B. Craig, P.Bozzolla, D. J. Penman and H.Migaud. 2013. Optimisation of triploidy induction in brown trout (SalmotruttaL.). Aquaculture.160–166.

Sayed, A. El-Din H., R.M.Zakib, A.M.K. El-Deanb,A.Y. Abdulrazzaq. 2015. The  biological  activity  of  new  thieno [2,3-c] pyrazole  compounds  as anti-oxidants  against  toxicity  of  4-nonylphenol  in  Clariasgariepinus.Toxicology  Reports. 2:1445–1453.

Sayed, A.H., H.S. Abdel-Tawab , S.S.A. Hakeem, I.A. Mekkawy. 2013. The protective role of quince leaf extract against the adverse impacts of ultraviolet-A radiation on some tissues ofClariasgariepinus(Burchell, 1822). Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology. 119:9–14.

Shahi, N.,  A.R. Yousuf, M.I. Rather, F. Ahmadand T. YaseeN. 2013. First report of blood parasites in fishes from Kashmir and their effect on the haematological profile.Open Veterinary Journal. 3(2): 89-95.

Share :